Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules TP BioCell 03 TEST MTT Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules Test de cytotoxicite titre
1. Obtention d’une suspension ajustée. plan
plan 1. Obtention d’une suspension ajustée. Rincer les cellules deux fois avec du PBS stérile. Ajouter de la trypsine-EDTA en quantité suffisante pour décoller les cellules. (environ 1 ml) plan Ajouter 3 ml de milieu complet et récupérer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger.
plan 1. Obtention d’une suspension ajustée. Centrifuger à 1 000 rpm pendant 5 mn puis jeter le surnageant en prenant garde de ne pas décoller le culot cellulaire. Reprendre le culot avec 1 ml de DMEM et homogénéiser doucement avec une pipette. plan Quand la suspension est homogène réaliser un test de viabilité au bleu Trypan - Diluer 0,05 mL de culture dans 0,2 mL de solution de bleu Trypan dilué au 1/10 en PBS - Compter à l'hématimètre
plan 2. Quantification colorimétrique des cellules (test MTT). 2.1. Influence du temps d’incubation. A partir de la suspension préparée, distribuer en double essai, dans deux barrettes 16 puits, les quantités de cellules calculées précédemment: Placer les cellules 30 minutes à 37 °C dans l'étuve à CO2 à 5 % plan Réaliser en Al à A4 les tests témoins pouvant servir de blanc optique. Distribuer 10 µL de solution de MTT dans les 4 rangées. MTT Incuber les cellules pendant 30 ou 60 minutes à 37 °C dans l'étuve à CO2 à 5 %. Après incubation, éliminer le milieu dans le récipient d'eau de Javel. 30 mn 60 mn Ajouter 100 µl de DMSO et agiter 10 minutes. Lecture de l'absorbance à 540 nm.
plan 2. Quantification colorimétrique des cellules (test MTT). 2.2. Etude de la sensibilité de la lignée au réactif HAT. La barrette fournie contient: - les cellules à tester - le milieu HAT Distribuer 10 µL de solution de MTT dans les deux rangées. plan Incuber les cellules 1h à 37 °C dans l'étuve à C02 à 5 % MTT Après ce délai, éliminer le milieu dans le bac de Javel. Ajouter 100 µl de DMSO et agiter 10 minutes. Lecture de l'absorbance à 540 nm.