Agriculture et alimentation brochure Obtention végétale = génie génétique vert Du laboratoire au plein champ Situation mondiale Denrée alimentaires Un produit génétiquement modifié pour la Suisse Autorisation, déclaration, valeurs seuils De nouveaux produits à l’horizon

Agriculture et alimentation brochure Obtention végétale = génie génétique vert Du laboratoire au plein champ Situation mondiale Denrée alimentaires Un produit génétiquement modifié pour la Suisse Autorisation, déclaration, valeurs seuils De nouveaux produits à l’horizon

Obtentions végétales = génie génétique vert Pages 42 à 47 Transfert indirect via une bactérie Agrobacterium tumefaciens Transfert direct

Transfert indirect de gènes Page 42 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Pathogène des végétaux → tumeurs au site d’infection (galle du collet) ? = Excroissance tumorale = zone de liaison entre tige et racine

Transfert indirect de gènes Page 42

Transfert indirect de gènes Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Structure Bâtonnet (bacille) + flagelles

Transfert indirect de gènes Page 43 Ti = inducteur de tumeur

Transfert indirect de gènes Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Localisation Sol

Transfert indirect de gènes Page 42 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 1.- Blessure au niveau de la plante (microblessures: insectes, vers, formation de racines latérales, gel… 2.- Emission de composés phénoliques 3.- Chimiotactisme d’Agrobactérium tumefaciens

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 4.- Composés phénoliques activent la région de virulence Code une endonucléase → ADN-T

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 5.- La bactérie est capable de se fixer aux Ȼ de la blessure 6.- La bactérie transfert une partie de son matériel génétique

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 7.- L’ADN-T s’intègre à celui de la plante 8.- La plante produit ↑ d’hormones de croissance

Transfert indirect de gènes Page 42 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 9.- Croissance désordonnée et illimitée des Ȼ infectées → tumeur

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 10.- La plante synthétise et libère dans le sol des opines 11.- Opines → nutriments pour Agrobactérium tumefaciens

Transfert indirect de gènes Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens Opines: - Petite molécule formée d’un acide aminé + acide cétonique ou un sucre - Source de C et N pour la bactérie

Transfert indirect de gènes Page 43 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens

Transfert indirect de gènes Page 44 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt Remplacement de l’ADN-T par un gène d’intérêt

Transfert indirect de gènes Page 44 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt Gène de sélection ? Gène permettant la survie des Ȼ dans des conditions particulières (résistance à un antibiotique) ou gène → molécule fluorescente ou radioactive…. Repérer facilement les Ȼ qui ont intégré l’ADN transgénique

Transfert indirect de gènes Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Provoquer des blessures chez la plante Fragments de feuille Fragments de tige Embryon Bactéries modifiées misent en contact avec les fragments de plante

Transfert indirect de gènes Page 44 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes

Transfert indirect de gènes Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Les fragments de plante sont cultivées sur un milieu sélectif (antibiotique) → Mettre en évidence la présence ou l’absence du gène de sélection Développement de cals (= amas de Ȼ végétales) transgéniques → plantules transgéniques portant et exprimant le gène d’intérêt.

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Transfert indirect de gènes Page 45 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Première plante modifiée par Agrobactérium tumefaciens = plante de tabac → résistante à certaines chenilles qui les dévorent jusqu’à la tige

Transfert indirect de gènes Page 45 Transfert de plasmide dans des Ȼ végétales Autres plantes: Tomate Pomme de terre Soja Coton … Pas de céréales

Transfert indirect de gènes Page 45 Agrobactérium tumefaciens n’induit pas de tumeur chez les céréales car elles ne produisent pas de composés phénoliques en cas de blessures en quantité suffisante pour permettre l’expression du gène « vir ».

Transfert indirect de gènes Depuis quelques années, des expériences ont été faites pour permettre la transformation du riz ou du maïs Comment ? Culture d’embryons de riz et d’Agrobactérium t. en présence de composés phénoliques → ↑ transfert (100%) Souches d’Agrobactérium t. « supervirulente »

Obtentions végétales = génie génétique vert Page 46 Transfert indirect via une bactérie Agrobacterium tumefaciens Transfert direct Différentes techniques (4)

Transfert direct de gènes Pages 46 - 47 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ végétales sans paroi cellulosique (enzymes)) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes ») Protoplastes Ȼ végétales

Transfert direct de gènes Page 46 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique (enzymes)) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

Transfert direct de gènes Page 46 Le polyéthylèneglycol (PEG) = agent chimique → déstabiliser la membrane plasmique des protoplastes → faciliter la pénétration de l’ADN

Transfert direct de gènes Page 46 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

Transfert direct de gènes Page 46 L’électroporation (technique plus délicate) = chocs électriques de fort voltage → ouverture de pores au niveau des protoplastes → faciliter le passage de l’ADN

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Transfert direct de gènes Page 46 Problème avec ces deux techniques Faible capacité de régénération des protoplastes Transfert de plusieurs copies → répercussions sur la stabilité de l’insert (gène) ou sur son expression

Transfert direct de gènes Page 46 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

Transfert direct de gènes Page 46 La microinjection (technique complexe) = introduction directe de molécules, organites dans des cellules isolées à l’aide de microseringues manipulées sous microscope

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Transfert direct de gènes Page 47 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

Transfert direct de gènes Page 47 La méthode biolistique ou canon à gènes = propulsion d’un transgène à l’intérieur de cellules végétales, isolées ou appartenant à un tissu ou à un organe - Constructions moléculaires sont fixées à la surface de projectiles microscopiques (billes d’or) - Bombarder les cellules végétales

Transfert direct de gènes Page 47 La méthode biolistique ou canon à gènes

Les protoplastes (application) Pages 47-49 L’hybridation somatique: = fusion des protoplastes (noyaux et cytoplasmes) - où ? - avantage ? - but ? Milieu approprié Surmonter barrières de la reproduction sexuée → espèces différentes (genre) Créer de nouvelles combinaisons ↑ productivité

L’hybridation somatique Page 47 Exemples de genres utilisés: Petunia Daucus Carotte Solanum Pomme de terre, tomate, aubergine… Croiser des espèces → combiner plusieurs qualités - résistances - fixation d’azote atmosphérique → ↑ productivité

L’hybridation somatique Page 47 Première expérience (1978) But: Solanum Tomate x pomme de terre = pomate → stérile tomates cultivables à basse température

L’hybridation somatique Pages 47 - 48 Technique (tabac): Centrifugation Sélection des hybrides

L’hybridation somatique Page 48 Autres expériences: Solanum tuverosum = Pomme de terre cultivée - Introduction de gènes de résistance - à certains virus - au mildiou - à la pourriture bactérienne X Solanum brevidens (A. Sud)

L’hybridation somatique Page 48 Comment peut-on faire fusionner les protoplastes (anions) ? Agents chimiques: 1.- Ca2+ et pH élevé → neutralisation charge électrique 2.- PEG → agrégation des ¢ + déstabilisation m.p → fusion Electrofusion: Champs électriques intenses de courte durée → déstabilisation m.p. → fusion + + +

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L’hybridation somatique Pages 48 - 49 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

L’hybridation somatique Pages 48 - 49 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 49 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique)

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 49 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique) Comment favoriser le transfert partiel ? En déstabilisant par irradiation l’ADN du donneur avant la fusion.

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 48

L’hybridation somatique Page 49 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

ADN mitochondriale et chloroplastique Fusion cytoplasmes Page 49 = les cybrides: Fusion des noyaux → 1 noyau après mitoses + cytoplasme recombiné Mitochondries Recombinaison Chloroplastes Recombinaison, 1 seul type ADN mitochondriale et chloroplastique Modifications des relations nucléo-cytoplasmiques

Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides: Page 49 Obtention provoquée des cybrides: Irradiations létales → ¢ du parent donneur → inactivation du noyau → transfert des mitochondries et des chloroplastes uniquement

Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides: Page 49 Obtention provoquée des cybrides: En plus, traitement à l’iodo-acétate → ¢ du parent receveur → inactivation des organites → transfert du noyau uniquement Cybrides c noyau (receveur) + organites (donneur)

Les hybrides retenus Page 49