Antirétroviraux et compartiment génital Dr Jade GHOSN 1er Forum interassociatif sur la transmission sexuelle du VIH TRT-5 - 27 Mars 2009 Laboratoire de Virologie CHU Necker-Enfants Malades EA MRT 3620 Paris 5 Service de Médecine Interne & Maladies Infectieuses CHU Bicêtre

Réservoirs anatomiques du VIH: le compartiment génital masculin Cellules germinales immatures Cellules épithéliales Spermatozoïdes Lymphocytes T CD4 Macrophages

Évolution virale spécifique dans le compartiment génital masculin Une autre façon d’explorer la population virale ds le liquide séminal est l’étude phylogénétique des quasi-espèces présentes ds ce compartiment. Ds l’étude menée par Kiessling et co, on voit aisément que les quasi-espèces virales isolées ds le sperme sont regroupées entre elles, et sont distantes des quasi-espèces virales isoées ds le sang, ce qui témoigne d’une évolution virale spécifique ds le compartiment génital masculin.

Quelle est la fréquence et le niveau de détection du VIH-1 dans le sperme des hommes non traités? L’ARN VIH est détectable dans le liquide séminal (LS) de plus de 90% des patients non traités. La charge virale dans le LS varie de 10 à 107 cp/ml. Corrélation entre CV dans le sang et dans le sperme: Dans 80% des cas le taux d’ARN VIH dans le LS est inférieur au taux d’ARN VIH dans le plasma sanguin (écart moyen de 0,6 log). Dans 20% des cas le taux d’ARN VIH dans le LS est supérieur au taux d’ARN VIH dans le plasma sanguin: - compartimentalisation avec production virale locale dans le sperme - IST

AIDS, 1999

Caracteristiques de 9 patients “Super Shedders” parmi une cohorte de 72 hommes non traités Pt Age IST CD4 BPVL SPVL SP/BP   Wk 0 ratio 56 48 no 480 2,400 14,000 5.83 66 35 NSU++ 190 920,000 >3,000,000 >3.26 32 33 Syphilis 138 63,990 970,000 15.16 72 54 439,900 603,990 1.37 51 52 275 53,990 130,000 2.41 21 34 Chlamydia 547 15,653 330,000 21.08 41 55 215 49 94 200,000 460,000 2.3 50 410 12,724 30,000 2.36 Median SSS 48* 3/9  (30%)* 63,990* 460,000* 2.41* N Shedder 35* 2/42 (4.8%)* 206 110,000 9,200* 0.12* Taylor et al 2003

Sexually Transmitted disease, Jan 2008

HAART avec IP et sperme Étude ANRS EP 12 N = 18 44% p=0.55 81% p=0.086 M6 5% p=0.051 29% p<0001 M18 0%* p=0.003 17% p<0.001 ARN VIH liquide séminal > 400 cp/ml ARN VIH plasma sanguin > 200 cp/ml J0 92% 100% M3 18% p=0.02 41% p=0.001 *= pour 3 hommes l’ARN VIH dans le liquide séminal était positif avec 292, 100 et 10 copies/ml M Leruez-ville et al , AIDS, 2002

Femmes traitées par les antirétroviraux : Production virale génitale Sang 100 Fuide cervicovaginal Naïves (n=12) Monothérapie (n=12) Bithérapie (n=12) Trithérapie (n=18) 75 Prévalence de détection (%) 50 25 ARN ARN ADN

particules virales libres virus archivés Sperme particules virales libres virus archivés Sang Liquide séminal Cellules rondes Pour tous les patients, un échantillon couplé de sang et de sperme a été prélevé le même jour à moins d’une heure d’intervalle Ns avons extrait et quantifié les particules virales libres présentes ds le SPERME et ds le sg, ainsi que les virus archivés ds les PBMC et ds les cellules rondes du sperme Ns avons séquencé les gènes de la TI et de la protéase afin de comparer les profils de R pour les 4 formes virales Les séquences du gène pol ont permis de réaliser une comparaison phylogénétique entre les virus du sang et du sperme Et l’origine des virus présents ds le liquide séminal a été explorée par clonage des différentes populations virales chez 3 patients ARN-VIH ADN-VIH Plasma sanguin PBMC

Résultats: Résistance du VIH et Compartiments Ghosn, AIDS 2004

Clones patient A: VN 09 Clones patient C: VN 14 Clones patient D: VN 15 0.01 A PBMC 1 A PBMC 8 A PBMC directe A PBMC 7 A PS 9 A PS directe A PS 1 A LS 3 A PS 7 A PS 6 A LS 6 A PBMC 10 A Cel R directe A LS directe A LS 10 A PS 2 A PS 3 A PS 4 0.01 C PBMC 6 C Cel R directe C Cel R 7 C Cel R 12 C Cel R 6 C Cel R 9 C PBMC 3 C PBMC 2 C PBMC 7 C PBMC directe C PBMC 8 C PBMC 1 C LS 2 C PS 7 C PS 10 C PS directe C PS 5 C LS 5 C PS 1 C LS 6 C LS 1 C LS 3 C LS 7 C LS directe 100 0.01 D PBMC 10 D Cel R 5 D PBMC 8 D PBMC 4 D PBMC 1 D PBMC 6 D Cel R 3 D PBMC dir D PBMC 2 D PBMC 9 D Cel R dir D PS 9 D PS 2 D PS 5 D PBMC 5 D Cel R 7 D LS 5 D LS 7 D PS 10 D LS 8 D PS 8 D PBMC 3 D LS 10 D LS 1 D LS 2 D LS 6 D Cel R 4 D PS dir D LS dir D PS 6 100 56 99 97 80 79 95 76 67 80 53 92 80 100 58 93 76 67 En vert PS En bleu PBMC En jaune LS En rouge Cel R Les séquances directes sont soulignées D’abord, diversité des quasi-espèces archivées par rapport homogénéité des virus récemment produits Deuxièmement, hétérogénéité moindre des quasi-espèces des Cel R par rapport à PBMC, ce qui peut faire évoquer l’hypothèse d’une dynamique différente ds le sperme Troisièmemet, ORIGINE du virus ds le sperme L’outil R vient confirmer 100 PS: plasma sanguin. PBMC: cellules mononucléées du sang périphérique. LS: liquide séminal. Cel R: cellules rondes du sperme. Les séquences directes sont soulignées.

Origine des souches VIH dans le sperme Les virus présents dans le sperme peuvent être le fait d’un transfert passif de virus provenant du compartiment sanguin mais aussi d’une dynamique de réplication virale locale (Eron, AIDS 1998, Kiessling, AIDS Research 1998, Mayer, CID 1999, Leruez-Ville, AIDS 2002, Ghosn AIDS 2004) potentialisée par une mauvaise pénétration des antirétroviraux dans le compartiment génital masculin (Kashuba, AAC 1999, Taylor, JAC 2001, Ghosn, AIDS 2004)

Tractus génital féminin (Si-Mohamed et al JID 2000)

Tractus génital féminin Protéase 10 20 36 46 50 54 63 71 77 82 84 90 (De Pasquale JAIDS 2003)

Indinavir Lopinavir

Réservoirs anatomiques du VIH et trt ARV cellules cibles activation immunitaire réponse immune locale barrières anatomiques Ces différences d’évolution virale et de profil de résistance peuvent s’expliquer par la composition des compartiments en question en terme de Cellules cibles du VIH État d’activation immunitaire et réponses immunes locales Et surtout par l’existence, pour certains compartiments comme le SNC ou le tractus génital, d’une BARRIERE ANATOMIQUE qui va limiter la diffusion des ARV ds le compartiment, lequel peut alors être assimilé à un SANCTUAIRE où le VIH échappe au TTT du fait d’une mauvaise diffusion des ARV Notion de SANCTUAIRE structure où le VIH échappe au traitement du fait d’une mauvaise diffusion des ARV

ARV 1 ARV 1 ARV 2 ARV 3 Plasma sanguin sperme Antiviral drug concentrations in semen of HIV-1 infected men Journal of Sexually Transmitted Infections 2001; 77:4-11. Stephen Taylor 1, 2 and Arlene S. Pereira 3 1. PHLS Antiviral Susceptibility Reference Unit, Division of Immunity and Infection, University of Birmingham, UK 2. Department of Sexual Medicine, Birmingham Heartlands Hospital, UK 3. Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina, Chapel Hill, North Carolina, 27599, USA Correspondence to: s.taylor.1@bham.ac.uk Key words. HIV, semen, antiretrovirals, drug concentrations, pharmacokinetics, protein binding. ABSTRACT Because semen is a major vehicle for the sexual transmission of HIV-1, control of viral replication within the sanctuary of the male genital tract should be a goal of antiretroviral therapy. Local immune responses, virus specific factors, and the degree of viral and cellular trafficking all appear to be important in controlling viral replication and evolution. However, the most important factor influencing viral replication and evolution within the male genital tract may be the disposition of antiretroviral agents into genital tissues and fluids. This review proposes possible mechanisms of antiretroviral distribution into the male genital tract by using other sanctuary barriers; such as the placenta, renal tubules, and blood-brain-barrier; as models. In addition, this review summarizes recent clinical studies regarding the disposition of currently available antiretroviral drugs into the seminal plasma and discusses some of the difficulties in interpreting drug concentration in the genital tract. Lipid Solubility Endothelial cells are essentially lipid membranes, and Frick’s Law applies to both. The partition coefficient (K) describes the equilibrium distribution of a drug between organic and aqueous phases in a two-layer system. In short, the coefficient predicts the likelihood of a drug diffusing across a membrane, or endothelial cell. [19] There is a hypothetical bell shaped relationship between the ability of a drug to diffuse across a membrane and its lipid solubility. Only drugs with some degree of lipophilicity and hydrophobicity should partition into and out of biologic membranes. [21] Figure 1 describes the effects of lipid solubility on membrane diffusion. Antiretrovirals and Lipophilicity Glynn et al.[21] experimentally determined the partition coefficient between octanol and phosphate buffered saline (pH 7.4) of various antiretrovirals, including didanosine (ddI), stavudine (d4T), zalcitabine (ddC), zidovudine (ZDV), nevirapine (NVP), indinavir (IDV), saquinavir (SQV), and amprenavir (APV). They also studied the diffusion, or permeability, of these antiretrovirals across bovine brain endothelial cells. As predicted, they found a bell-shaped relationship between lipid solubility and drug diffusion/permeability. Nevirapine is moderately lipophilic and most permeable. The nucleosides, although similar to nevirapine in size and molecular weight, are more hydrophilic and less permeable. The protease inhibitors (PIs) are more lipophilic than the other antiretrovirals in the study. Amprenavir is both slightly less lipophilic and more permeable than the other PIs studied. Table 1 describes the lipid solubility of select antiretrovirals. Ionization The degree of ionization is dependent on the pKa of the drug and the pH of its environment.[22],[23] Because the pH on one side of a membrane can differ from the pH on the other, ionization may differ between membrane separated compartments. Because ionization increases hydrophilicity, only non-ionized drugs diffuse through biological membranes. Ion trapping (or sequestering) occurs when ionization differs on the two sides of the membrane. At equilibrium, non- ionized drug concentration on each side of the membrane will be equal while total drug concentration (ionized and non-ionized) on the two sides can be unequal.[24] (Figure 1). Modified versions of the Henderson-Hasselbalch equation predicts the ratio, at equilibrium, between drug concentrations in two different solutions of known pH. [22],[23] Antiretrovirals and Ionization Ion trapping is an important concept, since the the pH of blood plasma (7.4) is almost a Log different from the pH of prostatic fluid (6.6). Thus, weak bases may accumulate in prostatic fluid. In fact, Henry et al.[25] suggested ion trapping as the mechanism for zidovudine accumulation (pKa 9.68) in seminal plasma. The pH gradient between blood plasma and vesicular fluid (pH 7.4 versus pH 7.8) is less dramatic; thus, it is unlikely that there will be any significant ion trapping for any drug in the seminal vesicles. Table 1 contains pKa values of selected antiretrovirals. Protein Binding—Size According to Frick’s Law, small drugs diffuse across membranes faster than large drugs. The effective size of a drug increases if it binds to macromolecules, including DNA and proteins. Thus, when a drug is bound, its diffusion rate becomes so slow that diffusion is negligible and only free (unbound) drug appreciably diffuses across biological membranes.[26]. Such binding is usually reversible with on/off rates and association constants. Drug accumulation can occur when the amount of drug binding differs on each side of the membrane. When binding differs, total drug concentration on each side of the membrane will be unequal while unbound drug concentration will be equal, at equilibrium (Figure 1). It has been hypothesized that greater than 80% binding is required to affect drug disposition.[26],[27],[28],[29] Antiretrovirals and Plasma Protein Binding Protein binding also affects the diffusion of antiretrovirals across membranes, including into target cells. Because current antiretrovirals only act within cells, it has been hypothesized that by studying the effects of extracellular proteins on intracellular antiviral activity one can indirectly determine the effects of protein binding on drug distribution. As organic bases, protease inhibitors are attracted to α1-acid glycoprotein (AAG). Zhang et al.[30] studied the effect of AAG on the antiviral efficacy of select antiretrovirals: SQV, ritonavir (RTV), IDV, nelfinavir (NFV), APV, and ZDV. As predicted, increasing AAG concentration causes a decrease in PI activity. Addition of AAG to PIs affects IDV activity the least; NFV, RTV, APV the most, and has a moderate effect on SQV. This corresponds to the degree of PI-AAG binding, with IDV being least bound (60%). Increasing AAG had no effect on ZDV efficacy, consistent with lack of ZDV-AAG binding. Table 1 describes the plasma protein binding characteristics of currently available antiretrovirals. Plasma sanguin sperme ARV 1 ARV 1 ARV 2 ARV 3 Taylor, Journal of Sexually Transmitted Infections 2001; 77:4-11

Protein Binding / Seminal Shedding 10 lamivudine zidovudine 1 indinavir Seminal Plasma:Blood Plasma Concentration Ratios nevirapine amprenavir 0.1 efavirenz saquinavir ritonavir 0.01 20 40 60 80 100 Protein Binding ( % ) Vernazza et al, Rev Med Micro 2001

le meilleur …de CROI 2008 Diffusion des ARV dans les tractus génitaux masculin et féminin (% moyen/plasma) APV (20 %) 600 % 500 % 400 % 200 % 100 % 300 % 80 % 60 % 40 % 0 % 3TC (400 %) IDV (200 %) ABC (8 %) ATV (18 %) APV (50 %) 20 % FTC (375 %) NVP (80 %) DLV (20 %) d4T (5 %) TDF (110 %) ZDV (235 %) LPV (8 %) RTV (26 %) EFV (0,4 %) ddl (21 %) SQV (ND) TDF (500 %) LPV (5 %) 3TC (600 %) NVP (70 %) d4T (2 %) ABC (150 %) ZDV (200 %) NFV (5 %) SQV (3 %) RTV (3 %) EFV (3 %) IDV (100 %) ENF (ND) Faible exposition du tractus génital dans le sang et le tractus génital Exposition identique Homme Femme Forte exposition du tractus génital MVC (410 %) Kashuba A, CROI 2008, Abs. 95

Ns avons effectué des dosages d’ARV sur les échantillons de plasma sangui et de liquide séminal de 13 ds 20 patients inclus ds l’étude précédente. Les dosages ont été réalisés par Gilles Peytavin à l’Hopital Bichat.

Diffusion de TDF, T20, EFV et IP dans le sperme Plasma Sperme 3230 - 6243 <50 40 85 55 381 1130 1840 <10 32650 10800 <40 466 T20 TDF EFV LPV 491 1260 660 1350 1860 2070 53 173 370 724 20 26 IDV APV SQV T20 T20 TDF TDF EFV LPV EFV LPV Plasma Plasma 3230 3230 - - 6243 6243 40 40 - - 85 85 1130 1130 - - 1840 1840 32650 32650 - - 10800 10800 Sperme Sperme <50 <50 55 55 - - 381 381 <10 <10 <40 <40 - - 466 466 IDV APV IDV APV SQV SQV Plasma Plasma 491 491 - - 1260 1260 1860 1860 - - 2070 2070 370 370 - - 724 724 Sperme Sperme Ns avosn été les premiers à évaluer la diffusion du tenofovir et de l’enfuvirtide dans le liquide séminal. Ns avons montré que l’enfuvirtide, du fait de son poids moléculaire élevé et de sa polarité, ne diffusait pas à travers la membrane hémato-testiculaire Alors que TDF, un inhibiteur nucléotidique proche des INTI, atteignait des concentrations optimales ds le liquide séminal. Pour résumer, ns avons montré que: La fréquence de souches résistantes était élevée ds le sperme de sujets en échec thérapeutique Que la mauvaise diffusion de certains ARV pouvait expliquer cette compartimentalisation de la R Et que l’étude limitée au sang ne pouvait dc que partiellement prédire le risque de transmission sexuelle de variants viraux résistants MAIS QU’EN EST-IL DE LA TRANSMISSION SEXUELLE DE CES VARIANTS VIRAUX?? 660 660 - - 1350 1350 53 53 - - 173 173 20 20 - - 26 26 Ghosn, Chaix, Peytavin et al, AIDS 2004

Quelles conséquences?

Transmissibilité des virus résistants dans le sperme ? Infrequent transmission of HIV-1 drug-resistant variants. (Yerly et al. Antivir Ther 2004). Diminished representation of HIV-1 variants containing select drug resistance-conferring mutations in primary HIV-1 infection. (Turner et al. JAIDS 2004). Plusieurs équipes ont suggéré que les variants viraux mutés résistants étaient peu transmissibles, essentiellement du fait de la diminution de leur capacité réplicative ou « fitness » due à la présence des mutations de R

De nombreux cas rapportés Transmission sexuelle et persistance de variants VIH-1 résistants aux ARV De nombreux cas rapportés Persistence and fitness of multidrug resistant human immunodeficiency virus type 1 acquired in primary infection (Brenner B et al. J. Virol. 2002) Persistence of transmitted drug-resistant virus among subjects with primary HIV infection deferring antiretroviral therapy (Little, Los Cabos, Juin 2003, Mexico). Persistence in HIV-1 protease of resistance mutations in absence of drug selective pressure three years after sexual transmission of a multiclass drug resistant variant (Ravaux I. IAS 2003, Paris) Transmission of HIV-1 variants resistant to the three classes of antiretroviral agents: implications for HIV therapy in primary infection. (Colson P,AIDS, 2002) Persistence of multidrug-resistant HIV-1 without antiretroviral treatment 2 years after sexual transmission (Delaugerre C, Antiviral Therapy 2004) Cependant, plusieurs équipes ont rapporté des cas de transmission sexuelle de variants viraux résistants, voire même multi-résistants AIDS, 2006

En France: données ANRS PRIMO et ANRS AC11 % 12 1996/1998, n=156 10 1999/2000, n=249 2001/2002, n=299 8 2003/2004, n=327 2005/2006, n=450 6 4 2 Résistance to at least one ARV Resistance to 2 or 3 classes Harzic AIDS 2002, Chaix AIDS 2003, Chaix-Descamps J. AIDS 2005, Chaix HIVWDR, 2007

Quid des nouvelles stratégies (1)? Bithérapie IP/r + INNTI: pas de données Monothérapie d’IP/r: Induction-maintenance avec ATV/r (Swindells, ACTG 5201, JAMA 2006) Sous-étude sperme pour 8/33 patients CV LS < 150 cp/ml à S24 chez 8/8 patients Induction-maintenance avec ATV/r (Vernazza, AIDS 2007) Sous-étude sperme pour 15/30 patients CV LS élevée chez 2/15 patients

Monothérapie par Kalétra® en 1ère ligne: essai MONARK Schéma de l'essai : essai randomisé ouvert Critère de jugement principal % patients avec CV < 400 c/ml à S24 ET < 50 c/ml à S48 LPV/r SGC 400/100 mg X 2/j, n = 83 96 semaines Sélection LPV/r SGC 400/100 mg + AZT/3TC 300/150 mg X 2/j, n = 53 Critères d'inclusion Patients naïfs CV < 100 000 c/ml CD4 > 100/mm3 S 24 S 48 Delfraissy JF., AIDS 2008

Objectif de la sous-étude Evaluer l’impact d’un an de traitement par monothérapie de Kalétra par rapport à une triple association classique avec AZT + 3TC + Kalétra sur la présence de VIH-1 dans le sperme. Postulat: L’origine du VIH-1 dans le sperme étant principalement due à une diffusion passive à partir du compartiment sanguin, l’efficacité du traitement antirétroviral dans le sang devrait indirectement réduire la présence de virus dans le sperme. Ghosn, JAC 2008

Patients et Méthodes Hommes participant à l’essai MONARK Ayant atteint la visite S48 Pas d’infection uro-génitale - Un échantillon couplé de sang et de sperme - Quantification de l’ARN-VIH dans le plasma sanguin et dans le liquide séminal - Mesure des concentrations de LPV et RTV dans le plasma sanguin et dans le liquide séminal Ghosn, JAC 2008

Résultats (1) 10 patients ont été inclus: CHU St Antoine, Paris: 4 CHU Hotel Dieu, Nantes: 3 CHU Bicêtre, KB: 3 Caractéristiques au moment de l’inclusion dans MONARK: Médiane pARN-VIH: 4.36 log10 cp/ml (4 – 4.88) Médiane CD4: 221/mm3 (132 – 289) Kalétra monothérapie: 5 patients AZT+3TC+Kalétra: 5 patients Ghosn, JAC 2008

Résultats (2) Suivi : 48 semaines Médiane ARN-VIH plasmatique à S48 < 50 cp/ml chez tous les patients Médiane ARN-VIH LS à S48: < 200 cp/ml chez les 5 patients sous CBV + LPV/r < 200 cp/ml chez les 5 patients sous LPV/r monothérapie Ghosn, JAC 2008

Résultats (3) Concentrations de LPV et RTV dans le plasma sanguin et le liquide séminal Ghosn, JAC 2008

Conclusions Chez ces dix patients inclus dans l’essai MONARK sans infection uro-génitale en succès virologique à S48 le contrôle de la réplication virale plasmatique a permis d’assurer également un contrôle dans le compartiment génital Chez les 5 patients sous Kalétra monothérapie, il n’a pas été mis en évidence de production virale locale dans le compartiment génital malgré des concentrations indétectables de LPV dans le sperme. Ghosn, JAC 2008

Conclusions (1) Fréquence élevée (70%) de souches VIH-1 résistantes aux antirétroviraux dans le compartiment génital masculin chez des patients en échec de traitement. Pour 30% de ces sujets, les profils de résistance aux antirétroviraux étaient différents entre les deux compartiments, avec notamment la présence de virus archivés différents dans les cellules rondes du sperme. Patients en succès avec CV plasmatique indétectable: Dans la grande majorité des cas, le contrôle de la réplication virale plasmatique assure également un contrôle dans les compartiments Charge virale détectable dans le sperme chez 2 à 5% en dehors d’IST (Vernazza, AIDS 2000/ Gunthard JID 2001/ Marcelin, AIDS 2008)

Quid des nouveaux IP et des nouvelles classes antirétrovirales? Conclusions (2) Le risque de transmission sexuelle de souches virales résistantes ou non est partiellement exploré par la seule étude du compartiment sanguin. Quid des nouveaux IP et des nouvelles classes antirétrovirales? L’impact des nouvelles stratégies antirétrovirales sur la population virale dans les compartiments anatomiques est à surveiller.