IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie Hôpital A. Mami de l’Ariana 25-26 Avril 2003 www.lab2m.tn

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEXE Mycobacterium tuberculosis: réservoir homme Mycobacterium bovis: réservoir bovin Mycobacterium africanum: Afrique noir MYCOBACTERIES NON TUBERCULEUSES ATYPIQUES Présentes dans l’environnement sans danger pour l’homme Responsable d’infections opportunistes chez les ID Pays développés: recrudescence de la tuberculose (SIDA) Nécessité d’identification des mycobactéries www.lab2m.tn MYCOBACTERIUM LEPRAE

CLASSIFICATION DE RUNYON GROUPE O : Les bacilles tuberculeux GROUPE I : Mycobactéries à croissance lente, photochromogènes GROUPE II : Mycobactéries à croissance lente, scotochromogènes GROUPE III : Mycobactéries à croissance lente, non chromogènes GROUPE IV : Mycobactéries à croissance rapide, pigmentées ou non www.lab2m.tn

Apparition des colonies ASPECT MACROSCOPIQUE M.tuberculosis M. africanum M.bovis M.bovis BCG Apparition des colonies 15-20j 60-90j 20-40j Aspect des colonies Eugoniques Rugueuses Chou fleur Beige Dysgoniques Plates Mate Lisses Hémisphériques Blanche www.lab2m.tn

ASPECT MACROSCOPIQUE www.lab2m.tn

PRODUCTION DE PIGMENT TECHNIQUE : Ensemencer deux tubes L et O avec une dilution 10-5, culture à 37°. Croissance sur tube L, illuminer tube O sous une lampe à fluoréscence RESULTATS : Mycobactéries sans pigmentation: Souche non chromogène ( gp III) Mycobactéries pigmentant sans illumination: Souche scotochromogène (gp II) Mycobactéries pigmentant à la lumière: Souche photochromogène (gp I) www.lab2m.tn

CULTURE DES MYCOBACTERIES www.lab2m.tn

ASPECT MICROSCOPIQUE M. tuberculosis: bien colorés, petits, incurvés M. kansasii: plus longs, aspect saucissoné,en échelle www.lab2m.tn

IDENTIFICATION PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES Indispensables Seuls à établir un diagnostic d’espèces Applicables sur les colonies obtenues par culture Mycobactéries tuberculosis complexe ≠ Atypiques www.lab2m.tn

NIACINE TEST Principe: Recherche de la niacine ou acide nicotinique Technique: R1: aniline à 4% dans alcool éthylique à 95° (fl brun à 4°) R2 :bromure de cyanogène à 10% dans ED (fl brun à 4°) Mode opératoire: +1ml ED dans un tube de culture, laisser en contact 15min, reprendre 0.5ml dans un tube et ajouter 0.5ml R1 +0.5ml R2: col jaune Résultats: M. tuberculosis: niacine + M. africanum: production variable M. bovis: Négatif Mycobactéries non tuberculeues: Négatif NB: Tests sur bandelettes (DIFCO) remplace cette manipulation www.lab2m.tn

NIACINE TEST www.lab2m.tn

NIACINE TEST SUR BANDELETTES www.lab2m.tn

REDUCTION DES NITRATES Techniques: R1: Sol de nitrate de Na 0.01M R2 : Hcl dilué R3 : sol de sulfaniline R4 : sol de alpha naphtylamine Mode opératoire: Mettre en suspension des colonies dans la solution1, incuber 2 heures à 37°, ajouter une goutte R2, deux gouttes R3 et deux gouttes R4 Résultats: Positif, virage de la coloration au rouge (intensité de la couleur: + jusqu’à 5+) M.tuberculosis: positif M.bovis et M. africanum: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif NB: Pour confirmer une réaction négative ajouter poudre de zinc www.lab2m.tn

TEST DE NITRATE www.lab2m.tn

THERMOSENSIBILITE DE LA CATALASE TECHNIQUE: Deux tubes contenant une suspension bactérienne dans tampon phosphate, un tube à température ambiante, l’autre à 68°c pendant 20 min. Après refroidissement ajouter 0.5ml de H2O2 à 30% RESULTAT: Positif, observation de bulles à la surface La catalase est thermolabile pour les 3 espèces pathogènes, thermorésistante pour les atypiques www.lab2m.tn

RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune BETA- GLUCOSIDASE TECHNIQUE: Suspension de colonies de culture dans 0.5ml de sol. de para nitrophényl ß-D glucoside, 3h à 37° RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune M.tuberculosis: positif M. bovis: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif (groupe I variable) www.lab2m.tn

Subtsrat: Disulfate de phénolphtaleine tripotassique dans ED UREASE EN MILIEU UREE-INDOLE M.tuberculosis: positif M.africanum: variable M. bovis: négatif ARYLSULFATASE Subtsrat: Disulfate de phénolphtaleine tripotassique dans ED Milieu: Dubos Réactif: Carbonate de sodium Technique: suspension de colonies de culture dans un tube contenant le substrat plus le milieu de Dubos, incuber 3 j à 37° et ajouter quelques gouttes de Na2CO3 Résultat: positif, coloration rouge (comparer à un tube étalon) Mycobactéries tuberculeuses: négatif Mycobactéries atypiques du groupe IV (complexe fortiutum et chelonae): Positif www.lab2m.tn

Hydroxylamine HYD à 250 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose UTILISATION DU MILIEU LÖWENSTEIN-JENSEN CONTENANT DIFFERENTS INHIBITEURS TECHNIQUE: Ensemencer avec 0.1ml de la dilution au 1/1000 de la suspension bactérienne, incuber 3 semaines à 37° P. nitrobenzoate PNB à 500ug/ml: Sensible pour les M.de la tuberculose: Hydroxylamine HYD à 250 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose Acide thiophène 2 carboxylique (TCH) à 2 ug/ml: Résultats: M. tuberculosis: Résistant M. bovis: Sensible M. non tuberculeuse: Résistant D-cyclosérine: Résistant avec BCG Pyrazinamide PZA à 50 et 100ug/ml: Résistant avec bovis Thiosemicarbazone Tb1 à 10 ug /ml : groupeIV www.lab2m.tn

IDENTIFICATION DES PRINCIPALES MYCOBACTERIES Groupe de de Runyon Mycobactérium spp Pigm ObLm T Temps N I A Uréase ARY GLU CT 68° PNB HYD TCH PZA DCS Tb1 gel MC Nacl Mycobacterium tuberculosis complexe tuberculosis bovis africanum BCG - 37 >10j + X Croissance lente photochromogene kansasii marinum - + 30 x II Croissance lente scotochromogène szulgai gordonae xenopi flavescens + + 40 III non chromogène avium malmoense gastri terrae triviale - - IV Croissance rapide fortiutum peregrinum chelonae abscessus 28 3-5j www.lab2m.tn