Clonage Moléculaire

Définitions Clonage : Sous-clonage: Plasmide recombinant: Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou d’une partie de celle-ci d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3

Étape 1- Séparer Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomique Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt

Réplication & Amplification d’ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne

Polymérases Amorce -OH Extrémité 3’OH Polymérase 5’…GTACT 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG Matrice d’ADN ou ARN

La Réaction de la Polymérase en Chaîne Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 7

PCR-1ier Cycle <3’GGAACGGTACCGT5’ Dénaturation (95oC) Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’>

5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ Extension (72oC) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 3’ 5’ --------------------------------  ----------------------------------  5’CCGTGGGGT3’> 9

PCR-2e Cycle 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- 5’ 3’ 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- Dénaturation -------------------------------  ----------------------------------  Appariement /Extension --------------- ----------------

PCR- Cycles Subséquents Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2n fois -------------------- ------------------- ------------------------ ------------------------ Rendement: N=No(2n) N: Nombre ou masse finale No: Nombre ou masse initiale ------------------------ 32 fois totale

Problème Vous souhaitez amplifier une séquence de 1 kb à partir de 10ng d’une matrice simple brin de 10 kb avec des amorces couvrant les positions 12-37 et 1007-1037. Combien de cycles faut-il pour obtenir 1µg du produit désiré?

Solution Déterminer la masse initiale du produit désiré 10kb = 10ng donc 1kb = 1ng ou 10-3µg (Simple brin) Double brin serait 2 X 10-3 µg Déterminer le nombre de cycles à partir de la masse initiale du produit désiré 1µg = 2 X 10-3µg(2n); résoudre pour n Approx. 9 Déterminer le nombre de cycles afin d’obtenir le produit double brin désiré 3 cycles Total: 9+3 = 12

Survol des Cycles du PCR Amorces: Courte séquence nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles 15-30 nucléotides Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices

Survol des Cycles du PCR Appariement: Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier Habituellement entre 55-75oC Extension: Fait à la température optimale pour la polymérase ADN Habituellement 72-75oC pour la polymérase Taq

Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt Établis le point d’initiation de la réplication Établis le point de terminaison de la réplication 16

Conception d’Amorces Complémentarité 5’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice CCATAACCGG-OH3’ 5’CGA Complémentarité 3’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice TACCCATAACC TA-OH3’ 17

Conception d’Amorces 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ Région d’intérêt 3’ Bonne orientation Mauvaise orientation 18

Amorces 2 amorces sont requises pour une amplification exponentielle Amorce « Forward » Amorce dont la séquence est la même que celle de la matrice indiquée Amorce « Reverse » Amorce dont la séquence est complémentaire à celle de la matrice indiquée Exemple 3’-GCGGTT••••••••••ATCGTTA-5’ Amorce « Forward »: ATTGCTA Amorce « Reverse »: CGCCAA

Problème 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’ Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 20

Utilité le la PCR Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relative Entre 100pb et 10Kpb Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêt Présence ou absence d’un produit d’amplification Mutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 21

Cloner Enzyme de restriction Enzyme de restriction Générer des extrémités compatibles Ligature d’ADN Vecteur approprié Fragment d’intérêt Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Transformation Cellules Hôte Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante 1 plasmide/1 cellule

Amplification des Plasmides Recombinants Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne

Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques Cartographie de restriction PCR