Clonage Moléculaire
Définitions Clonage : Sous-clonage: Plasmide recombinant: Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit
Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3
Étape 1- Séparer Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomique Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt
Cloner Enzyme de restriction Enzyme de restriction Générer des extrémités compatibles Ligature d’ADN Vecteur approprié Fragment d’intérêt Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Transformation Cellules Hôte Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante 1 plasmide/1 cellule
Amplification des Plasmides Recombinants Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne
Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques Cartographie de restriction Hybridation PCR
Expression Pourquoi? Produire la protéine dans un système hétérologue Produire la protéine en grande quantité Purifier la protéine Étudier l’activité de la protéine
Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II Partie I Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ Partie II Clonage de LacZ dans pUC19 Partie III Esai enzymatique des protéines recombinantes
Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1 Purification par QiaQuick Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer les amorces Permet de retirer l’enzyme Digestion Sites de restriction BamHI et EcoRI ont été ajoutés à la séquence de l’amplicon Absent dans la séquence de Mel 1 Présent dans le site de clonage multiple du vecteur d’expression (pRS424) Permet le clonage dirigé