Techniques Utilisant Un Immuno-marquage Université de Ammar Telidji Faculté de Médecine Module d’Immunologie Techniques Utilisant Un Immuno-marquage Immunoradiologiques Immunoenzymatiques Immunofluorimétrie 2018-2019

Introduction L’immuno-analyse mets à profit la réaction spécifique Ac-Ag in vitro les techniques d’immuno-analyses courantes utilisent pour la plupart un traceur détectable pour révéler et quantifier la réaction Ag-Ac Avantage: sont des technologies très performantes (sensibilité** -fiabilité -rapidité) avec des applications majeurs en biomédicale. Marqueur = entité (atome, molécule, ion…) lié chimiquement à un Ag ou Ac, et délivrant un signal direct ou indirect , quantitativement mesurable.

Grands types de marqueurs Radio-isotopes: émission d’un rayonnement Fluorochrome: émission d’une fluorescence Enzymes: catalyse de la formation d’un produit coloré On appelle un Ac marqué ou un Ag marqué =un CONJUGUÉ

MÉTHODES PAR COMPÉTITION RIA/FIA/EIA (notre échantillon) Ag non-marqué + Ag* marqué de la même nature entrent EN COMPÉTITION pour la liaison au niveau des sites d’Ac spécifiques disponibles À l’équilibre: le % des (Ag*-Ac) est inversement proportionnel à la concentration de la substance que l’on veut doser (Ag)

L’Ag à doser se lie aux anticorps fixés MÉTHODES EN SANDWICH IRMA/IFMA/ELISA L’Ag à doser se lie aux anticorps fixés Ensuite, l’Ag est révélé par un deuxième anticorps marqué (qui se fixe sur un autre épitope) On mesure le signal émie par la fraction liée du conjugué qui est proportionnel avec la concentration en antigène à doser

Techniques immunométriques Par compétition entre l’élément recherché et son homologue marqué Sur un nombre déterminé de sites Ac Utilisable pour tous les antigènes y compris les haptènes En sandwich En excès d’anticorps Plus spécifique car elle utilise deux épitopes (sites antigéniques) différents de l'antigène Plus sensible inutilisable pour les haptènes. RIA / FIA /EIA Techniques immunométriques IRMA /IFMA /ELISA

Méthodes radio-immunologiques Ex: 123I 124I 125I** 131I Les radio-isotopes sont des atomes dont es noyaux sont énergétiquement instables qui émets par un processus spontané l’énergie excédentaire sous forme de rayonnement ionisants  La quantification fait appel au compteur gamma  Des méthodes ultrasensibles, dosage des hormones, des médicaments, des marqueurs tumoraux .. , dans les milieux biologiques

Méthodes radio-immunologiques RIA (Radio Immuno Assay) Par Compétition, méthode par défaut d’anticorps, méthode inversement proportionnelle

Méthodes radio-immunologiques IRMA: Immuno Radio Metric Assay (Radio-immunodosage par excès d’anticorps, Technique en sandwich, directement proportionnelle)

Sensibilité très élevée L’isotope permet un marquage facile Avantages Applications Sensibilité très élevée L’isotope permet un marquage facile Signal direct Signal spontané Allergologie : IgEt, IgEs,… Auto-immunité: Ac anti-ADN natif… Endocrinologie: dosages hormonaux (FSH, LH, TSH,…) Obstétrique: bêta-HCG,… Pédiatrie, Hématologie: facteurs de croissance (GH, IGF1,…) Cancérologie: marqueurs tumoraux,… Contraintes La réglementation Manipulation et surveillance délicate La péremption du traceur : (décroissance radioactive, radiolyse)

Méthodes d’immunofluoresence Principe : un anticorps est couplé à un fluorochrome qui est excité par une lumière (UV) va émettre une lumière fluorescente (verte ou rouge …) **observation au microscope à UV. Exemples de fluorochromes: Isothiocyanate de fluorescéine Rhodamine

Passage des électrons à un état excité: Absorption d’une lumière avec un faible longueur d’onde Retour à son état fondamental: par émission d’une lumière fluorescente avec une longueur d’onde plus grande 490 520nm FITC: Fluoresceine Iso-Thio-Cyanate

TROIS types d’IF: Directe OU indirecte , avec double marquage ***Dans tous les protocoles des lavages soigneux sont réalisés pour éliminer les produits non fixés

Réaction d'immunofluorescence directe IFD Une section est coupée sur un cryostat à partir d’un morceau de tissu congelé; La solution standard d’anticorps fluorescents est appliquée sur la coupe sous forme d’une goutte, incubée et éliminée par lavage; L’anticorps fixé est ensuite révélé sous microscope; Le schéma de fluorescence est caractéristique pour chaque antigène tissulaire ou cellulaire. **Nécessite le marquage de l'Ac spécifique ce qui limite ses applications.   Ex: La recherche de dépôts tissulaires d'Ig ou de c3 dans les biopsies tissulaires (peau, rein) Pour le phénotypage de population lymphocytaires B et T (CD4+ CD8+)

Immunophénotypage cellulaire

Techniques d’IFD (TRI CELLULAIRE) (Cytométrie en flux)

Réaction d'immunofluorescence indirecte IFI pour la recherche d'Ac (immuns ou auto-immuns) dans un milieu biologique. Elle représente la technique de choix dans le diagnostic immunologique, dépistage, screening des maladies auto-immunes qu'elles soient spécifiques ou non spécifique d'organe.   Immun sérum anti-immunoglobulines humaines marquées à un composant fluorescent (FITC) Les anti-globulines proviennent d'un mélange de sérums obtenus après immunisation d'un lot d'animaux (chèvre ou lapin) avec des gammaglobulines d'origine humaine (IgG,IgA purifiées) Possibilité d’analyser plusieurs anticorps à la fois Semi-quantitative (l’inverse de la dilution donnant encore une fluorescence positive)

Techniques d’Immunofluorescence Techniques d’Immunofluorescence Indirectes (IFI) Recherche et titration des AUTO-ANTICORPS Fluorescence Sérum du patient Excitation UV Conjugué F F F F F F F Lecture - Coupe de tissu - Suspension cellulaire

Après IFI, Chaque anticorps appartenant au groupe des anticorps antinucléaires a un aspect et une topographie caractéristique qui est visible en fluorescence

Exemple: Recherche des anticorps anti-ADN caractéristiques du Lupus Érythémateux Disséminé (Maladie auto-immune systématique: pommettes inflammatoires formant un " masque de loup ", problèmes cardiaques, rénaux) : le sérum du patient est testé sur des coupes de 4 µm de rein de souris, riches en cellules nucléées, ou sur des étalements de lignées cellulaires en culture, dont la membrane a été perméabilisée après incubation et lavage, les lames sont lavées puis incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines humaines, marqué à la fluorescéine la présence d’anticorps anti-ADN dans le sérum du patient permet la fixation des anticorps marqués et "illumine" les noyaux avec un aspect particulier, très homogène.

Réactions de double marquage (direct) Utilisation de Fluorescéine et Rhodamine

DOUBLE MARQUAGE (INDIRECTE) F Conjugué Ac de cheval anti-Ig de lapin marqué par la fluorescéine Excitation UV Fluorescence verte orange Ag1 Ag2 Ac primaire de lapin Anti-Ag1 Ac primaire chèvre Anti-Ag2 Conjugué Ac de cheval anti-Ig de chèvre marqué par la rhodamine détection simultanée de deux antigènes dans une coupe de tissue par technique d’immunofluorescence indirecte UTILSANT 2 MARQUEURS

MICROSCOPE à fluorescence (à lumière UV) Contraintes: ** Sources lumineuses excitatrices susceptibles de fluctuation ** Problème spécificité du signal

Techniques immunoenzymatiques Méthodes pratiques et simples qui ont remplacé les techniques radio-immunologiques On mesure l’activité enzymatique (par une réaction colorée, apparition d’un produit coloré à partir d’un substrat incolore initialement = chromogène) La spectrophotométrie permet la mesure de la densité optique DO du signal coloré qui est corrélée avec la quantité de la molécule mesurée la fixation de l’enzyme sur l’anticorps ne doit pas affecter l’activité catalytique de l’enzyme ou la réaction Ag-Ac Il existe plusieurs variantes ou schémas réactionnels basées sur un concept de base identique.

Système biotine-avidine: Exemples d’enzymes utilisées et de méthodes de fixation de l’enzyme à l’Ac: Enzymes Substrats Produits Phosphatase alcaline PNPP (4-nitrophényl-phosphate) incolore PNP (4-nitrophénol) (jaune) 405 nm Peroxydase H2O2 + OPD (orthophénylène diamine) H2O2 + luminol Produit coloré (orange) Produit luminescent -galactosidase ONPG (2-nitrophényl - galactoside) ONP (2-nitrophénol) (jaune) 405 nm Glucose 6-phosphate déshydrogénase Glucose 6-phosphate + NAD+ ou NADP+ NADH ou NADPH, 340 nm Système biotine-avidine: Le couplage indirect fait intervenir deux molécules présentant de l'affinité l'une pour l'autre, chacune étant fixée par un pont covalent à l'antigène d'une part et à l'enzyme d'autre part  Couplage chimique: est réalisé à l'aide d'un réactif bi fonctionnel comme le glutaraldéhyde, qui établit un pont covalent entre deux atomes d'azote (fonctions amines) des protéines.

1- Techniques Immuno-enzymatiques qualitatives Directes: Immunohistochimie et immunocytochimie ANTIGÉNE TISSULAIRE: Substrat Insoluble E E E E E E E E E échantillon: Coupe de tissue - Suspension cellulaire

1- Techniques Immuno-enzymatiques qualitatives Indirectes (Immuno-dot et Immuno-blot) ANTIGÉNE SOLUBLE Échantillon: Sérum du patient Conjugué Substrat insoluble E E E E E E E Ag fixé sur une membrane de nitrocellulose IgG-IEF

(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 2- Méthodes enzymatiques quantitatives: Peuvent être réalisées en phase homogène ou hétérogène Plusieurs montages sont disponibles (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) Cette technique est la technique ELISA "vraie" On appelle aussi ELISA les autres techniques immunoenzymatiques en phase hétérogène, par extension

2- Techniques Immuno-enzymatiques quantitatives ELISA Sandwich Conjugué Sérum du patient E Substrat E E E E E E Densité optique [Ag]

2- Techniques Immuno-enzymatiques quantitatives ELISA Indirecte Sérum du patient Conjugué E Substrat E E E E E E Densité optique [Ag]

MICROPLAQUES ELISA (96 puits)

APPLICATIONS Recherche et dosage d'anticorps pour le diagnostic de maladies infectieuses (sérologie bactérienne) : en parasitologie (toxoplasmose…) et en virologie (virus de l'hépatite B, virus du SIDA…), également recherche d’Ac en auto immunité… Dosage spécifique de certaines protéines plasmatiques : IgE (totales et spécifiques), ferritine, dosages hormonaux (hCG), dosages de médicaments, recherche de marqueurs tumoraux: alpha-foetoprotéine… recherche d’Ag bactériens, viraux, fongiques, parasitaires