Des Protéines aux Gènes … (Première partie) Jérôme GARIN Laboratoire de Chimie des Protéines CEA/INSERM/UJF (Génopole Rhône-Alpes)

L’avènement de la Post-Génomique GENES ARNm PROTEINES Génomique (33.000 gènes) Transcriptomique Protéomique (106 formes protéiques ?) Maturation Modif. Post-Trad. Demi-vie Localisation Partenaires

Les outils de la Protéomique

Digestion des protéines par la trypsine Les outils de la protéomique Digestion des protéines par la trypsine Lys Arg Lys Trypsine Peptides Arg Lys Lys

Source nano-electrospray Les outils de la protéomique Spectrométrie de masse en mode tandem : sélection et fragmentation des peptides NanoESI-MS/MS Détecteur Analyseur ToF Source nano-electrospray Quadrupole Sélection des ions Cellule de collision Fragmentation

Séquençage des peptides par nanoESI-MS/MS Les outils de la protéomique Séquençage des peptides par nanoESI-MS/MS R P Q G M W E 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 % 554.33 159.09 288.14 272.17 685.37 871.46 1000.49 Banques Protéiques ou Génomiques BLASTP tBLASTN EWMPGQPR ....VGRRHGSRVSKSAEWMPGQPRPPHLDGSAPGD....

Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics ») Les outils de la protéomique Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics ») nanoLC MS/MS Colonne capillaire RP (75 µm x 15 cm) Séparation Peptides + concentration (profil UV) Spectres MS/MS

Interprétation des données (haut débit) Les outils de la protéomique Interprétation des données (haut débit) Données théoriques Digestion trypsique in silico des banques protéiques Sélection des n protéines pour lesquelles on attend un peptide trypsique de masse m Données expérimentales Masse du peptide trypsique (m) + Spectre MS/MS n spectres MS/MS théoriques 200 400 600 800 1000 1200 100 % 554.33 159.09 288.14 272.17 685.37 871.46 1000.49 MASCOT

Interprétation des données (haut débit) Les outils de la protéomique Interprétation des données (haut débit) Banques de données protéiques MASCOT Protéome (spectres MS/MS)

Quelques chiffres … 2003 : nanoLC-MS/MS « Haut débit » : 100 - 1000 protéines/jour « Haute sensibilité » : 20 femtomoles/protéine 1996 : Séquençage d’Edman « Haut débit » : 1 protéine/jour … « Haute sensibilité » : 20 picomoles/protéine

La Protéomique : un outil d’annotation fonctionnelle des Génomes

Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiques Protéomique et annotation fonctionnelle des génomes Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiques Cl-/NO-2 HCO3- Porin Porine K+/Na+ Ca2+ ATP ADP H+ SO42- HPO42+ Glycerate/Glycolate Glu/Gln OAA/Mal Mal/Glu Pyrophosphate Glucose CO2 NO2- Characterized activity (unknown sequence) Pi/TrioseP Ca2+ ADP ATP Porin ATP/ADP PEP/Pi 2-OG/Malate Proteins Amino acids Characterized activity (known sequence) Metals Vitamins Amino acids Fatty acids H2O Predicted activity (unknown sequence)

Protéomique et annotation fonctionnelle des génomes Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiques Envelope chloroplaste SDS-PAGE Protéines très hydrophobes (solubles en chloroforme/méthanol) Peptides trypsiques Trypsine NanoLC-MS/MS 3 Transporteurs déjà connus 22 Transporteurs hypothétiques Nombreux spectres MS/MS non attribués MASCOT

Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiques Protéomique et annotation fonctionnelle des génomes Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiques Génome Pepline Protéome (spectres MS/MS) Génome Protéines hypothétiques Gènes hypothétiques Exons hypothétiques Banques de données protéiques MASCOT Protéome (spectres MS/MS)

Myriam FERRO Romain CAHUZAC Gilles ANDRE Jérôme GARIN Jacques JOYARD Norbert ROLLAND Erwan RÉGUER Estelle NUGUES Alain VIARI Yves VANDENBROUCK