Université Dr. Yahia FARES de Médéa Faculté des Sciences Section Sciences de la Nature et de la Vie Master 1 immunologie et maladie infectieuse Module: technique de biologie moléculaire. Présenté par : HABES Amel Encadré par :Mme BENCHRITE

 Blot est une méthode de transfert protéines, ADN, ARN TYPE OF BLOTTING TECHNIQUES

Egalement appelé “immunblot” Technique utilisée pour identifier une protéine dans un échantillon contenant plusieurs protéines Qu’est-ce que le Western Blot? Comment ça marche ? Les protéines d’un échantillon sont séparées par électrophorèse en fonction de leur masse moléculaire Un anticorps spécifique est ensuite utilisé pour détecter la protéine d’intérêt Le résultat permet de déterminer le poids moléculaire et la quantité relative de la protéine

La protéine d’intérêt est-elle présente dans mon échantillon ? Est-ce que le traitement de mon échantillon par un agent « X » augmente ou réduit le niveau d’expression de ma protéine ? Le niveau d’expression de la protéine est-il différent selon le type de tissu ou le type de cellule ? Mon échantillon est-il sain ou pathologique ? Western Blot permet de détecter par exemple la maladie de Lyme, de la vache folle, HIV, etc

Préparation des échantillons Gel d’électrophorèse Transfert des protéines Immunodétection Révélation

1.Lyse : Localisation de protéinesTampon de la lyse recommandé Cytoplasmique (soluble)TriS-HCL Cytoplasmique (cytosquelette )Tris-Triton NucléiqueRIPA Membrane plasmiqueNP-40 MitochondrieRIPA

2.Un tampon de charge type contient du SDS (sodium dodecyl sulfate) et du β- mercaptoéthanol ou DTT (dithiothréitole)

II. SDS PAGE ou électrophorèses Définition : Méthode permettant de séparer les protéines grâce à un champ électrique en fonction de leur mobilité électrophorétique. SDS : Sodium Dodecyl Sulfate ; PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

 Habituellement composé d’un produit chimique Substance inerte, telle que NITROCELLULOSE ou PVDF ( PolyVinyliDene Fluoride ).  Le processus de transfert protéines d'un gel à une membrane Tout en maintenant leur parent les positions et les résolutions sont connues comme blot. III.Transfert de la membrane

Les membranes PVDF requièrent un prétraitement au méthanol

 comment déterminer quelle bande correspond à la protéine d’intérêt ?  L’utilisation d’anticorps détectant la protéine d’intérêt permet de répondre à cette question en fixant uniquement la protéine d’intérêt.

IV.Immunodetectation

V.Révélation La révélation se fait sur la même membrane que la révélation de la protéine d’intéret

Apres quantification de l’intensité des bandes avec le logiciel on peut calculer le rapport du signal étudier Sur celui témoin de charge certain figure scientifique expose ainsi le résultat de western blot sous forme d’histogramme

Mon échantillon est-il sain ou pathologique Western Blot permet de détecter par exemple la maladie de Lyme, de la vache folle, HIV, etc Mon échantillon est-il sain ou pathologique Western Blot permet de détecter par exemple la maladie de Lyme, de la vache folle, HIV, etc

Le dépistage HIV se fait de la façon suivante : -Test ELISA effectue en premier lieu - Si le test est positif, un deuxième test ELISA s’effectué - Si toujours positif, WESTERN Blot comme confirmation car ELISA peut donner des « faux positif » Western blot : recherche spécifique des anticorps anti-HIV du patient

Glycoprotéine de la membrane : GP160, GP110/120 et GP 41 Protéine membranaire : P24/25 Protéine de la capsule interne : P18 Protéine internes : P55, P40 Transcriptase inverse : P68, P52 Endnucléase : P34 COMPOSITION DU HIV

EXPLICATION DU METHODE Le principe est de détecter les anticorps anti- HIV du patient par immuno-empreinte. Permet de caractériser les anticorps dirigés contre chacune de protéines virales très spécifiquement.

ELECTROPHORESE SUR LE GEL La première étape est la dénaturation du virus par un détergèrent SDS ou autre agent. Les protéines virales (antigènes) sont séparé selon Les critère de masse par électrophorèse sur le gel de polyacryamide. La dernière étape consiste au transfert des protéines sur un buvard (blot) de nitrocellulose.

La bandelette de nitrocellulose est incubée avec le sérum du patient contenant (ou non )des anticorps anti-HIV LES anticorps spécifiques se lient aux antigènes de blot La bandelette est rincée pour faire partir les anticorps non complexés L’INCUBATION

Le complexe antigènes-anticorps est révélé par un deuxième anticorps couplé à une enzyme Le nouvel anticorps se lie au complexe lors de l’incubation Les anticorps non liée sont rincé Au contact du substrat de l’enzyme une couleur apparait LA RÉVÉLATION

Deux bandes témoins sont utilisées : Contrôle positif : synthétisée en mettant en contact les antigènes du blot avec tous les AC complexant. Cela révéler l’emplacement sur le blot chaque complexe Contrôle négatif : sans présence des AC  Une bande de contrôle interne : elle contient des immunoglobulines à la place des antigènes de départ. Ceci permet la vérification du bon déroulement de la réaction enzymatique BANDES TEMOINS

Le test est considéré positif si la présence de deux glycoprotéines membranaires, d’une tierce protéine membranaire ou interne du virus ainsi qu’une enzyme sont détectés Le résultat (indéterminé) peut faire suspecter une séroconversion ou éventuellement une réaction croisée avec d’autres rétrovirus Profil Positif2 ENV ± GAG ± POL Indéterminé1 ENV ± GAG ± POL ou GAG + POL ou GAG ou POL NégatifAucune bande ou bandes non répertoriées Interprétation

Cas n 01 : patient récemment infecté Etude de cas 1 ere examen : Western blot négatif, c’est la primo-infection Ensuite augmentation dans le temps des anticorps anti-HIV la séroconversion.

Cas n 02 : patient malade Dans ce cas, la disparation des anticorps anti-HIV en fin de SIDA témoigne de l’effondrement de système immunitaire du sujet

Conclusion A partir d’un mélange contenant de nombreux protéines le western blot permet de relever spécifiquement la présence d’une protéine données et de contrôler sa taille et de mesurer sa quantité relative par rapport a un témoin