Les infections à cytomégalovirus MC Mazeron octobre 2006

FAMILLE DES HERPESVIRIDAE SOUS FAMILLE Espèce Alpha-herpesvirinaeHerpès simplex type 1HHV1 Herpès simplex type 2 HHV2 Varicelle-zonaHHV3 Beta-herpesvirinaeCytomégalovirusHHV5 Herpès virus humain 6HHV6 Herpès virus humain 7HHV7 Gamma-herpesvirinaeEpstein-BarrHHV4 Herpès virus humain 8HHV8

Cytomégalovirus Epidémiologie Réservoir : strictement humain Virus ubiquitaire Séroprévalence élevée dépend des : conditions socio-économiques 100% dans régions du tiers-monde où l ’infection est acquise très tôt dans la vie 50% en France habitudes sexuelles (MST)

Capside icosaédrique ADN linéaire double brin 230Kpb Glycoprotéines d ’enveloppe nm Tégument Protéines de la nucléocapside (Polyamines) Enveloppe phospholipidique

U L U S UL54 UL97 TR L : Répétition terminale longue, IR L : Répétition interne longue IR S : Répétition terminale courte, IR L : Répétition interne courte U L : Région unique longue, U S : Région unique courte, région a 230 kb, 200 cadres de lecture ouverts Génome du cytomégalovirus. Localisation des gènes UL97 et UL54.

EPIDEMIOLOGIE DES SOUCHES DE CMV Profils de restriction Rsa I de UL10-13 A M

ANALYSE D'UNE SEQUENCE DE UL55 Hinf I Rsa I T D A M T D A Chou and Dennison, JID, 1991

pp65 pp71 gB, gH IE E L Golgi noyau cytoplasme gM

ADN CMV IEA EA LA UL54 ADN répliqué IEA :UL UL36-38 US3 Cycle de réplication EA : ADN pol, UL44, Hélicase, DNAse gpUL55 etc… LA : struct

Multiples par contact direct Voie sexuelle (sperme et sécrétions cervico-vaginales infectés), respiratoire, contact avec excrétions virales (urines de nouveau-nés, salive...) Greffe d ’organe ou de moelle (cellules souches hématopoïétiques) Transfusion sanguine : PSL non déleucocytés (actuellement, les PSL sont systématiquement filtrés) Mère au fœtus ou au nouveau-né Cytomégalovirus Voies de transmission

INFECTION A CMV Primo- Virémie Organes cibles infection réplication Virus Greffon urine larmes sperme... RéinfectionLatence Immunodépression Stimulation allogénique Réactivation

Physiopathologie de l’infection à CMV Modifications du métabolisme cellulaire Tropisme Dissémination hématogène Latence et réactivation Transplantation Athérosclérose

Expression des molécules d’adhésion et de re-circulation Production des cytokines Régulation de facteurs de transcription Apoptose et cycle cellulaire Interaction de l’infection virale avec le métabolisme cellulaire

Tropisme cellulaire In vivo : très large chez l ’homme => cellules endothéliales => cellules épithéliales => cellules fibroblastiques => monocytes-macrophages In vitro : Cycle de réplication complet =>Cellules d ’origine humaine uniquement Fibroblastes embryonnaires +++ Autres types cellulaires Cycle de réplication abortif =>Certains types cellulaires d ’origine humaine ou animale

Tropisme cellulaire Récepteurs exprimés sur un grand nombre de cellules Cellules cibles in vivo monocytes/macrophages (latence, dissémination virale) endothéliales (dissémination virale) souches myélomonocytaires, stromales de MO (inhibition de la formation de colonies=> effet sur l’hématopoïèse) musculaires lisses (ulcérations TD, athérosclérose?) trophoblastiques (transmission materno-fœtale) épithéliales, fibroblastiques (poumon) glandulaires, gliales, neurones Réplication virale état de différenciation cellulaire

Bentz et al, J Virol 2006 Dissémination hématogène

INFECTION A CMV : SITES DE LATENCE Types cellulaires Monocytes du sang circulant (0,01% des monocytes chez un individu naturellement infecté) => différenciation en macrophage => réplication Progéniteurs de la moelle osseuse CD34+ (monocytes CD33 CD14); (granulocytes CD33 CD15); (cellules dentritiques CD33 CD 15 CD1a) (Khaiboullina et al, BJH, 2004,126:410) réservoirs de virus persistance de l’infection Cellules endothéliales? (Reeves et al, J Gen Virol, 2004,85:3337) Cellules épithéliales et fibroblastes…? Tissus Nombreux : poumon, colon, rein, cerveau, foie …..

Comment s ’établit et se maintient l ’état de latence ? Echappement à la réponse immunitaire Mécanismes moléculaires de maintien du génome viral dans les cellules

Diffusion par passage de cellule à cellule fusion cellulaire entre cellule infectée et cellule non infectée : connections cellulaires induites par l’infection virale (Digel et al, J Clin Virol, 2006, 37:10) Liaison du virion à la bêta-2-microglobuline protection vis-à-vis des anticorps neutralisants? système alternatif d ’infection?  ECHAPPEMENT A LA REPONSE IMMUNITAIRE HUMORALE

ECHAPPEMENT A LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE Régulation négative de l'expression des molécules MHC de classe I et II à la surface des cellules infectées => Résistance à la lyse par les lymphocytes cytotoxiques CD8+ (classe I) => Obstacle à la présentation des épitopes viraux aux cellules T helper (classe II) Immunosuppression transitoire par diminution de l ’activité des LCD4+ et augmentation des LCD8+ Expression restreinte dans les cellules non permissives Inhibition de la présentation des antigènes très précoces Séquestration des CC chimiokines (RANTES, MCP-1)

MAINTIEN DE LA LATENCE 1. Forme du génome: Absence d ’intégration de l ’ADN viral dans le chromosome Forme circulaire, épisomale démontrée dans les monocytes CD14+ du sang circulant de sujets en bonne santé (Bolovan-Fritts CA, Blood 1999, 93:394) les cellules NT2 en culture (Meier, J Virol, 2001,75:1581)

MAINTIEN DE LA LATENCE 2. ARN transcrits et protéines produites in vivo et in vitro : sens et antisens (région IE) dans les progéniteurs CD33+ in vitro : nombreux gènes exprimés dans les cellules CD34+ (résultat global) mais « pattern » différent de celui observé dans les cellules permissives ou lors d’une infection abortive Goodrun et al, PNAS, 2002, 99:16255 in vitro : récepteur de CC et CX3C chimiokines US28 dans les cellules THP-1 (lignée monocytaire)

MAINTIEN DE LA LATENCE 3. Déacétylation des histones in vitro : dans les cellules NT2 modification de l ’ADN viral (désacétylation des histones) différenciation => acétylation du MIEP et réactivation (transcription à partir du promoteur activateur très précoce majeur)

MAINTIEN DE LA LATENCE 4. Inhibition de la différenciation cellulaire  Inhibition de la différenciation des monocytes en macrophages (interaction du virus avec les monocytes) Gredmark, J Virol, 2004, 78, Gredmark, J Immunol, 2004, 173,4897

REACTIVATION CHEZ LE SUJET IMMUNOCOMPETENT Episodes de réactivation prouvés par Mise en évidence d ’une excrétion virale intermittente dans l ’ urine, le sperme, les sécrétions cervicales Mise en évidence de virémie : exceptionnelle Oscillation du titre des anticorps Exemple : CMV détecté par culture et /ou PCR dans le sperme de 5 /175 donneurs (étude CECOS en France)

REACTIVATION ET IMMUNODEPRESSION Episodes de réactivation au cours du sida chez les receveurs d ’allogreffe au cours d ’hémopathies malignes au cours de traitements immunosuppresseurs : corticothérapie par ex (MICI) Echec de l ’hôte à éliminer les cellules infectées productrices de virus infectieux

REACTIVATION ET DIFFERENCIATION CELLULAIRE Modèles in vitro : cellules de tératocarcinome embryonnaire (NT2) différenciation induite par l ’acide rétinoïque en phénotype neuronal => expression des IE In vivo : différenciation Monocytes Macrophages

STIMULATION ALLOGENIQUE Transfusion de produits sanguins labiles contenant des leucocytes Réactivation du virus endogène (phénomène démontré dans un système expérimental chez la souris) Réactivation du virus du donneur Allogreffe de moelle ou d ’organe Réactivation du virus endogène (receveursd ’allogreffe de moelle) Réactivation du virus du donneur (receveurs de greffe de foie ou de rein) Rôle de l ’allostimulation dans un modèle murin (Hummel, J Virol, 2001, 75, 4814)

CMV ET TRANSFUSION InfectionAllostimulation MONOCYTE latente RéactivationDifférenciation active MACROPHAGE (CD1a, CD83), (CD14, CD64)

CMV et transplantation Greffe de moelle et pneumopathie interstitielle Processus immunopathologique ? Effet cytopathique direct ? Greffe d’organe et rejet Rejet favorisé Surexpression des protéines d’adhésion Cytokines inflammatoires Infection favorisée Immunosupression augmentée Stimulation allogénique

CMV et athérosclérose Types cellulaires potentiellement impliqués cellules endothéliales, musculaires lisses, macrophages, polynucléaires Inflammation Inhibition de l’apoptose des cellules musculaires lisses Mobilité des cellules musculaires lisses

Infection par le cytomégalovirus Conséquences cliniques Dépendent étroitement de l ’état immunitaire de l ’hôte Immunité normale : infection bénigne Immunodépression cellulaire (allogreffe, sida) : risque de maladies sévères à l ’occasion de la PI ou d ’une infection secondaire => diagnostic précoce => traitement spécifique Infection du fœtus et du nouveau-né après transmission in utero : risque d ’atteintes sévères et de séquelles neuro-sensorielles surtout si PI de la mère

Primo-infection par le cytomégalovirus Inapparente dans 90% des cas Inaperçue Symptomatologie banale et bénigne, pseudogrippale, non diagnostiquée Forme classique Syndrome mononucléosique Formes compliquées Formes sévères

CMV Syndrome mononucléosique FréquentsRares SymptômesFièvreDysphagie MyalgiesDiarrhée Arthralgies Malaise Céphalées Toux Examen cliniqueSplénomégalie (30%) Rash HépatomégalieErythème pharyngé Adénopathies (25%)

Syndrome mononucléosique Complications PoumonPneumopathie interstitielle PeauEruption maculo papuleuse FoieHépatite Système nerveuxSyndrome de Guillain-Barré Méningoencéphalite CœurMyocardite, péricardite Tube digestifUlcérations SangAnémie hémolytique Thrombopénie ŒilRétinite, uvéite, conjonctivite

Syndrome mononucléosique Formes sévères Cas exceptionnels 40 cas décrits dont 3 chez les femmes enceintes Evolution souvent mortelle Association de localisations hépatique, pulmonaire, encéphalitique =>Diagnostic rapide => Traitement spécifique

Infection à CMV Pouvoir immunosuppresseur du virus de la réponse proliférative vis-à-vis d’Ag viraux ou bactériens, L CD8 + => inversion du rapport CD4+/CD8+ de l ’activité NK Anticorps Ac antinucléaires Facteur rhumatoïde Stimulation allogénique de la synthèse d’Ac dirigés contre d’autres antigènes

CMV Syndrome mononucléosique Biologie Hématologie Syndrome mononucléosique Délai d’apparition : souvent après 2 semaines d’évolution du syndrome clinique Lymphocytose entre 55 à 86% Lymphocytes atypiques : 12 à 55% des lymphocytes totaux Thrombopénie Biochimie Cytolyse hépatique (Elévation des transaminases)

Infection du receveur d ’allogreffe Modes d ’infection PI (transmission par le greffon) Réinfection (chez 86% des R de greffe de rein séro+) Réactivation (R de greffe de moelle séro+) => Etape clé : REACTIVATION de la souche du D ou du R Incidence : variable selon la greffe Délai de survenue de 1 à 4 mois après greffe en l ’absence de trt préventif Symptomatologie : PI : 2/3 des cas Réinfection : 40% des cas Réactivation : <20% des cas

Conséquences de l ’infection à CMV en transplantation d ’organe Stimulation allogénique Infection active Immunodépression Maladie à CMV signes généraux localisation Immunodépression Lymphomes EBV induits Inf opportunistes Dysfonction du greffon => rejet aigu => athéroscléroserejet => bronchiolite oblitérantechronique

Conséquences de l ’infection à CMV au cours du sida Stade avancé d ’immunodépression => < L CD4+/mm 3 Localisations préférentielles œil => rétinite => cécité TD => ulcérations (colon +++, œsophage…) SNC neuropathies périphériques Myélites Encéphalites

Transmission mère-enfant Transmission in utero Très fréquente (1% des nouveau-nés infectés) A l ’occasion d ’une infection active (PI ou IS) Risque d ’infection sévère après PI maternelle en cours de grossesse (risque si ré-infection ? à considérer) Transmission périnatale Très fréquente (sources multiples de virus) Evolution habituellement favorable

Avt grossesse AC-AC+ Grossesse PIIS 35 à 50%<5% Infection fœtale Nouveau-né SymptomatiqueAsymptomatique 10%30%60%5 à 15%85 à 95% Dvpt DécèsSéquellesDvptNormal

Sérologie Anticorps de type IgG et IgM Avidité des anticorps de type IgG Diagnostic direct Recherche de la dissémination sanguine recherche d’une localisation viscérale Diagnostic de l ’infection à CMV

Méthodes de diagnostic direct Effet cytopathique in vivo exemple : cellules à inclusion, cellules endothéliales Culture sur fibroblastes embryonnaires humains « classique » => Isolement (ECP) rapide Mise en évidence des antigènes intracellulaires leucocytes du sang périphérique : antigénémie pp65 excrétion virale (LBA), tissus (immunocytochimie) Détection des acides nucléiques viraux ADN et ARN

Cellule endothéliale, infectée par le CMV, circulante

Isolement du virus effet cytopathique sur cellules MRC-5 (état frais) Coloration au Giemsa Inclusions cytoplasmiques et nucléaires

Culture rapide Inoculation à des FEH Centrifugation de l’inoculum sur les cellules => adsorption Incubation 24 à 48 h Fixation et coloration Révélation en immunopéroxydase ou immunofluorescence des IEA Avantages Rapidité, quantification relative, sensibilité Inconvénient pas de souche isolée

Détection d’antigène Antigénémie pp65 2x10 5 leucocytes en spot (cytocentrification) IF révélant ag nucléaire pp65 Avantages : rapidité, simplicité, sensibilité, quantification Inconvénient : manipulation longue, lecture, délai entre prélèvement et manipulation < 3 h Antigènes de cellules diverses LBA, apposition sur lame de tissus… IF révélant IEA ou LA Avantages : rapidité, simplicité Inconvénient : sensibilité faible

Détection des acides nucléiques viraux ADN viral: Hybridation (peu utilisée) PCR simple ou nichée PCR en temps réel : en plein développement => détection qualitative ou quantitative seuil variable selon la technique (techniques « maison », trousses commercialisées) ARN messagers Technologie NASBA => trousses commercialisées

Monocytes ADN viral Polynucléaires Virus infectieux Antigène pp65 ADN viral PlasmaADN viral DISSEMINATION SANGUINE Infection active Couche leucocytaire Sang total

MARQUEURS SANGUINS DE L’INFECTION INFECTION Virus activeAg pp65latente ARNm tardifs ADN génomique leucocytes plasma sang total PCR ultra sensible PCR à visée diagnostique

Syndrome mononucléosique à CMV Forme classique DIAGNOSTIC DIRECT VirémieAgpp65ADNL (PCR) 1 mois21%50%100% 2 mois023,5%81% 3 mois0040% 6 mois0016,6% > 6mois000 Urines : excrétion peut être prolongée, intermittente Sperme

Localisations de la maladie à CMV OrganePrélèvementTechniqueCliniqueAnapath ColonBiopsies Cult/PCR+++++ FoieBiopsie* Cult/PCR+++ Œil HA et/ou vitré *PCR++++- PoumonBiopsie *Cult/PCR+++++ LBACult/PCR- SNCBiopsie cérébrale* Cult/PCR+++++ LCRPCR- * exceptionnellement pratiqué

Rétinite à cytomégalovirus Aspect non hémorragique

Infection à CMV chez le receveur d ’allogreffe de moelle ou d ’organe Dépistage systématique de l ’infection active Prélèvements systématiques de sang =>antigénémie pp65, => PCR quantitiative (leucocytes, sang total, éventuellement plasma) Mise en route d ’un traitement anticipé (préemptif) Diagnostic et traitement de la maladie à CMV

charge virale Probabilité Relation entre charge virale et risque de survenue de la maladie à CMV Cope AV, JMV 1997,52,200

Diagnostic de l ’infection à CMV au cours du sida Chercher une dissémination sanguine Rétinite diagnostic clinique Tube digestif clinique et aspect endoscopique biopsies digestives étagées : anapath et viro SNC PCR sur LCR

Infection à CMV transmission mère-enfant Femme enceinte diagnostic d ’une infection active diagnostic de l ’infection primaire ou secondaire Fœtus prélèvement de liquide amniotique après 22 semaines d ’aménorrhée échographie Nouveau-né recherche de virus dans les urines (15 premiers jours de vie) prélèvements fonction de la symptomatologie

MOLECULES ANTIVIRALES ADN polymérase virale GCV CDV PFA UL97 GCVp CDVp GCVpp GCVppp CDVpp Kinases cellulaires

TRAITEMENT Traitement d ’attaque de 14 à 21 jours (GCV ou PFA) ou 2 perfusions (1/semaine) pour le CDV Traitement d ’entretien : => Maladie à CMV chez les patients immunodéprimés => Toxicité des molécules disponibles hématologique pour le GCV rénale pour PFA et CDV

PREVENTION Infection Post transfusionnelle : => PSL filtrés systématiquement (+ donneur séro- pour les receveurs les plus à risque) Infection ou maladie chez les Receveurs de greffe => prophylaxie => traitement anticipé Transmission mère-enfant => conseils d ’hygiène aux femmes enceintes séronégatives Vaccination : Travaux en cours