Cancer du sein Statut HER2 et IHC L’importance de la phase technique

Détermination du statut HER2 par IHC et FISH/CISH

Oncogène HER2, chr 17q1-2 Surexpression de la protéine Activation par amplification Surexpression de la protéine L ’oncogène HER2/neu appelé également ERBB2 est l ’un des oncogènes important du processus de tumorigenèse mammaire. Il est situé sur le bras long du chromosome 17 Il est activé dans 15 à 30% des cancers du sein. Son activation correspond à une amplification c ’est à dire la présence d ’un grand nombre de copies deHER2/neu dans le noyau des cellules tumorales. Il n ’a pas été décrit d ’autre processus d ’activation du gène HER2/neu en particulier pas de mutation ni de translocation L ’amplification s ’accompagne dans la très grande majorité des cas d ’une surexpression de la protéine

Cancers inflammatoires 30% Cancers de la femme jeune Tumeurs HER2 (+++) Lobulaires < 5% Canalaires < 2 cm 10 à 15% > 2 cm 20 à 25% grade I 0% grade II 11% grade III 27% Cancers inflammatoires 30% Cancers de la femme jeune De nombreuses études se sont intéressées à HER2 comme marqueur en oncologie mammaire. L ’ensemble des données publiées montre qu e HER2 est un marqueur de progression tumorale. En effet dans les cancers canalaires de moins de 2cm, la surexpression n ’est observée que dans 10 à 15% des cas , dans ceux de plus de 2cm, elle est de 20 à 25% Dans les formes de présentation clinique grave sein inflammatoire et cancer de la femme jeune, cette surexpression est observée dans au moins 30% des cas. De façon paradoxale dans les cancers in situ , la surexpression est de 40% et de 90% dans les maladie de Paget.

Détermination du statut de HER2/neu Hybridation in situ en fluorescence (FISH) et Chromogenic in situ hybridization (CISH) : amplification du gène Immunohistochimie (IHC) : expression de la protéine Dans ce contexte, il est indispensable de disposer d ’une méthode de détermination du statut de HER2/neu fiable et reproductible. Les méthodes reposant sur l’analyse morphologique du tissu tumoral sont les méthodes de choix.La FISH permet de déterminer l ’existence d ’une amplification du gène l ’IHC la surexpression de la protéine cible.

Les cellules tumorales des cancers du sein Nombre de chromosomes anormaux +++ ( aneuploïdie) Dr AURIAS, Institut Curie, Paris HER-2: 17q21.1

Sur-représentation d’HER-2 des polysomies 17 des translocations déséquilibrées du 17q 6 copies de HER2 Dr COUTURIER, Institut Curie, Paris Translocation déséquilibrée 17q

Est-ce que le statut HER2 est stable, ou peut être acquis au cours de l’évolution tumorale ? Travail de Meng S PNAS 2004

Etude sur 33 patientes stade I à IV Meng S, PNAS 2004 Etude sur 33 patientes stade I à IV Comparaison de l’amplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER2 -

Etude initiale sur 33 patientes HER2- Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; Pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou Herceptin avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives.

2ème étude sur 24 patientes HER2- Evaluation sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » et en rechute 9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression Les 9 patientes ont alors reçu Herceptin®  2RP et une RC

Critiques de l’étude Les niveaux d’amplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. Pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale ? Pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? Plusieurs hypothèses se discutent : Le statut HER2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) La CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification  La cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection d’un clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale

Conclusion Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale, au niveau des métastases

Amplification  Surexpression x10 Cible des traitements anti HER-2 = protéine HER-2 exprimée à un haut niveau (IHC 3+) Surexpression à haut niveau d'HER-2 (3+) = liée à l'amplification du gène Les surreprésentations donnent des hyperexpressions de faible niveau Leur réponse au traitement n'est pas connue  Objectif : détection des hyperexpressions/amplifications vraies

Détermination du statut HER-2 par FISH Technique idéale ‘’gold-standard’’ : - reproductibilité > à l'IHC - échecs identifiables (fixation BOUIN ++) - résultat sous forme d'une variable discontinue (numérique) Plusieurs limitations : - investissement en microscopie en fluorescence - coût plus élevé que l'IHC (210 €) - nécessité d'un personnel entrainé - fixation FORMOL ou Formol-Ac Acétique Indications : - calibration de l'IHC - détermination du statut des IHC 2+

Hybridation in situ principe Visualisation in situ du nombre de copies d'un gène Sur coupe à partir de tissu congelé, ou fixé Lecture en référence à l'histologie, identification des structures invasives intérêt par rapport aux méthodes moléculaires +++ La sonde visualisée soit par l'intermédiaire . d'un fluorochrome (FISH) technique de référence . d'un chromogène (CISH)

2 types de kits approuvés FDA FISH HER-2 2 types de kits approuvés FDA - sonde HER-2 seule (Oncor/Ventana; Zymed)  n. de copies HER-2 - sonde HER-2 + cent 17 (Vysis/Abott; Dako, …)  rapport copies HER-2 / copies cent 17 Un impératif : distinguer les amplifications des sur-représentations

FISH HER-2 amplifications sur-représentations >10copies centromère 17 HER-2 6 copies HER-2 cent 17

FISH HER-2 recommandations - HER-2 : > 6 copies - HER2/cent 17 : > 2.2 * Les amas de signaux (hsr) signent les amplifications. Donner les nombres de signaux HER-2 Vérifier HER-2/cent 17 en cas de 6-7 copies HER-2 Archiver les images (contrôle de qualité) Recommandation : afin de ne détecter que les amplifications vraies  seuil ratio HER2/Cent 17 > 3 *ASCO 2006, recommandations JCO

Cas non amplifiés CISH Dr ARNOULD, Dijon 2 spots 5 spots

Cas avec amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon

Vérification par FISH du centromère du chr 17 Faible amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon 6 spots Vérification par FISH du centromère du chr 17

Immunohistochimie : avantages Visualisation de la protéine in situ spécificité de l’évaluation de la surexpression quantification de la protéine cible Largement répandue Sensible Automatisable et standardisable Faible coût Polyclonaux (A0485, Herceptest®), monoclonaux (CB11, PathwayTM de Ventana, SP3 de lapin …)

Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène La surexpression de la protéine HER2 est spécifique des cellules tumorales. Il s ’agit d ’ une protéine trans-membranaire qui appartient à la famille du récepteur de l ’EGF qui participe à la transduction du signal mitotique et donc à la croissance tumorale. Elle représente la cible d ’un traitement spécifique antiHER2. Cas (++) Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène

Cas (+++) Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène

IHC : inconvénients Grande sensibilité Fixation inadéquate : altération des antigènes Pas de seuil de positivité consensus

Concordance statut HER2 FISH et IHC 90% Si… immunohistochimie calibrée nombre de cas testés par an suffisant

« Discordances » FISH / IHC < 10% amplification sans surexpression surexpression sans amplification

65 à 80% des cas Pas d’amplification Pas de surexpression

Fort niveau d’amplification 15% à 30% des cas Fort niveau d’amplification Surexpression forte +++

40% 60% Surexpression modérée ++ 5% des cas dont : Faible niveau d’amplification 60% Pas d’amplification

Herceptest® (Dako) Anticorps primaire polyclonal ( A0485) Sur tissus fixés en FORMOL neutre tamponné Réactifs prêts à l’emploi Témoins : lignées cellulaires, nombre déterminé de copies HER2/neu Système de lecture standardisée

Comparaison Herceptest® / FISH Jacobs : J Clin Oncol, 1999, 17, 1974 - 82 Pauletti : J Clin Oncol, 2000, 18, 3651- 64 Lebeau : J Clin Oncol, 2001, 19, 354 - 63 Tubbs : J Clin Oncol, 2001, 19, 2714 -21 Perez : Mayo Clin Proc, 2002, 77, 148-154 Dowsett : J Pathol, 2003, 199, 418-423 Ainsworth : J Clin Path 2005, 58, 1086-1090 positivité faible (++) : 6 à 87 % de faux positifs positivité forte (+++) : 6 à 25 % de faux positifs Peut être une trop grande sensibilité mais la dernière version du kit donne de très bons résultats dans le respect strict des conditions de fixation non alcoolique, l’utilisation de témoins externes issus du laboratoire et dont le niveau d’amplification a été préalablement analysé l’apprentissage de l’interprétation

Recommandations pour calibrer l’IHC sur la FISH et maintenir la concordance entre les 2 techniques Arch Pathol Lab Med, 2003, 127, p 549 Modern Path, 2003, 16, p 173 Histopathology, 2003,42, p 337

Conditions de fixation, préparation des coupes Fixation optimale en FORMOL neutre tamponné moins d’1h après la résection chirurgicale moins de 48h fragment de 0.5 à 1cm d ’épaisseur Préparation des blocs et coupes conservation des blocs de paraffine à 20 à 25°C réalisation des coupes idéalement moins d’une semaine avant à 20- 25°C au maximum 4 à 6 semaines avant la technique d’immunohistochimie à condition d’un stockage à 4°C 3 à 5µm d’épaisseur

Calibration de la technique Conditions de réaction calibrées sur FISH témoins lignées cellulaires pH du tampon de pré-traitement (pH : 6) Choix de l’anticorps : monoclonal ou polyclonal Dilution de l’anticorps primaire CB11 : 1/500 à 1/800 A0485 : 1/500 pour le formol 1/400 pour l’AFA Adapter la dilution à chaque changement de technique, y compris entre deux automates identiques mais plus ou moins neufs (expérience de Claudius Regaud, Toulouse)

Témoins Utilisation de contrôles : lignées cellulaires, fixées comme le tissu analysé bloc multi-tissulaire (0, ++, +++) : nombre de copies connues par FISH Bloc choisi avec tissu normal, en évitant le tissu décalcifié Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur

témoin interne négatif de réaction Glandes normales : témoin interne négatif de réaction Augmenter la dilution de l’anticorps primaire si marquage des glandes normal

témoin positif de réaction Surexpression forte +++ Maladie de PAGET témoin positif de réaction Fort niveau d’amplification Surexpression forte +++

Témoin (++) amplifié (témoin intermédiaire très utile) À obtenir auprès d’un centre expert FISH Sur un des cas du laboratoire (condition de fixation et préparation des blocs identiques aux cas à tester )

Calibrage de l’immunohistochimie Contrôle de qualité interne (1) Pas de marquage des glandes normales Coupe d’un bloc multi-tissulaire inclus à chaque manipulation : forte amplification (forte surexpression) amplification modérée (intensité modérée) pas d’amplification (pas de marquage)

Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité interne (2) Fréquence des cas positifs : 15 à 30% Retester 5% des cas positifs et négatifs / an CURIE en 2005: 24 cas 3+: 100% concordance avec la FISH 4 cas 8 copies HER2 18 cas > 10copies 2 cas NI 19 cas négatifs 100% concordance avec la FISH

En cas de surexpression de HER2 sur la tumeur primaire Tumeur primaire Métastase HER2+++ bronchique médullaire

HER2 et récepteurs hormonaux corrélation inverse HER2 IHC+++ ou FISH positif HER2 négatif RO + 10 à 49% 80% RP + 8 à 24% 53% Lal et al Am J Clin Pathol 2005 Koneckny JNCI 2003 Taucher et al Cancer 2003 Huang et al, Annals of Oncology , 2005

Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité externe : Résultats à vérifier par FISH / CISH Entraînement et formation du personnel Tests nationaux (AFAQAP) 1 test / an européen (UK NEQAS) 4 tests / an

Indications de la détermination du statut de HER2 En 2007, idéalement : au diagnostic initial de carcinome infiltrant (ASCP 2006) !! Ou bien : Patientes métastatiques N+ N- avec critères de prescription de chimiothérapie adjuvante et/ou d’hormonothérapie adjuvante

En pratique Regrouper les manipulations Validation vérification de la conformité des témoins externes, détermination du niveau de l’intensité de la manipulation du jour ++++ Interprétation des cas par le médecin ayant signé le diagnostic.

Interprétations Prendre en compte Le marquage membranaire Le % de cellules carcinomateuses infiltrantes L’intensité du marquage Pas de seuil validé sur la réponse au traitement

Le score Absence de marquage ou < 30% des cellules non + Indication Herceptin Absence de marquage ou < 30% des cellules non + Marquage faible et incomplet de >30% de cellules ++ Marquage faible ou modéré et complet de >30% de cellules Oui seulement si amplification prouvée par FISH +++ Marquage fort et complet de > 30% des cellules oui

Surexpression hétérogène de HER2 situation exceptionnelle TESTER LA METASTASE GANGLIONNAIRE ou VISCERALE

Algorithme test HER2 IHC oui 3+ 10x marquage membranaire complet non 20x ou 40x 1+ non marquage membranaire complet > 30% cellules non 2+ oui

Algorithme général test HER2 Tumeur mammaire IHC 3+ Traitement anti HER2 FISH / CISH + Traitement anti HER2 – 2+ Retester par FISH ou CISH – HER2/Cent 17 1,82,2 compter plus de cellules en FISH ou retester en IHC Statut HER2 équivoque + Traitement anti HER2 Réf. : HERA, BCIRG, NSABP B31, FIN HER

Conclusion HER2 surexprimé dans ~ 15-20% des cancers du sein Thérapeutique anti HER2 spécifique Analyse de HER2 par immunohistochimie APRES CALIBRAGE sur la FISH fiable rapide standardisable contrôle de qualité indispensable

IHC Aspects méthodologiques

Exemple du Protocole Curie Septembre 2006 Echantillons tissulaires fixés en AFA , coupes à 3µm Démasquage antigénique par dénaturation thermique dans 400 ml tampon citrate 10 mM à pH 6,1, pendant 20’  Anticorps CB11 (Novocastra), dilué au 1/800   Préparation de la dilution par un référent technique, 62.5 µl de l’AC primaire CB11 Novocastra (ref NCL-CB11), dans 50ml de diluant ZYMED (ref 00-32-18), aliquoté en tube de 5 ml stériles , stockés à 4 ° dans le réfrigérateur de la pièce d’immunomarquage, un aliquot est utilisé à chaque manipulation, à sortir sur GLACE pour préparation de la manipulation. Incubation 60 min Automate LABVISION Révélation : complexe ABC Vectastain Elite de chez Vector Contrôle externe : bloc composé de 4 tissus (3+ amplifié à plus de 10 copies, 2+ amplifié à 8 copies, 0 à 2 copies et un fragment de glandes normales)

Exemple du Protocole centre Jean Perrin Clermont-Ferrand Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate pH 6.0 (réf: ChemMate S2031 Dako) pendant 40 min au Bain Marie à 97°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps Ventana clone 4B5 prédilué (réf: 800-2996) temps de pose de l’anticorps 28 min avec l’automate Nexes de Ventana Révélation par le kit iView DAB Détection Ventana (réf: 760-091) avec l’automate Nexes

Exemple du Protocole centre René-Huguenin Saint Cloud Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate pH 6.0 pendant 40 min au Bain Marie à 95°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps polyclonal Dako (A0485) temps de pose de l’anticorps 30 min, automate Autostainer Dako Révélation par le kit DAB Dako (réf: K5001) Contrôle externe punch 3+, 2+, 0 contrôlés par Fish

Exemple du Protocole Institut Paoli Calmette Echantillons tissulaires fixés en FA , coupes à 3 µm Démasquage antigénique par Bain Marie(95-99°) tampon KIT Herceptest TM pH6 pendant 40’, refroidir 20’ Anticorps polyclonal de lapin prédilué KIT Herceptest TM  (30’) prêt à l’emploi non aliquoté Autostainer (DAKO) Révélation :DAB/KIT Contrôle externe TMA avec 3+,2+,0 contrôlés en FISH

Généralités Anticorps = Protéine de haut PM (Famille des glycoprotéines) Conformation complexe de la protéine fragilité Compromis de la fixation : morphologie et antigénicité Fixation et démasquage: un couple à optimiser

Durée de fixation Le délai avant fixation le plus court Durée de fixation 24 à 48H

Fixation Choix du fixateur Délai de fixation Taille de l’échantillon Volume pièce / volume de fixateur

Bon compromis entre morphologie et antigénicité Fixateur Solution de formaldéhyde à 4% dans sa forme tamponnée Idéale pour FISH et IHC (pontant) A.F.A (alcool formaldéhyde, acide acétique) (coagulant) Bon compromis entre morphologie et antigénicité

Déshydratation-Imprégnation L’eau contenue dans les tissus sera progressivement remplacée par la paraffine (Ethanol puis Toluène ou xylène..) Infiltration des échantillons par la paraffine (ou mélange paraffine + polymères) à 56-58°C (point de fusion de la paraffine !!! Attention à la paraffine trop chaude >60°C) afin préserver certaines propriétés chimiques et l’immunoréactivité

Séquence des solvants Ethanol 4h Toluène 5h Paraffine 3h 58°C* Pour un cycle de nuit 12h Séquence automatisée vide / pression/T° programme spécial pour le week-end en prolongeant l’étape la moins délétère : TOLUENE (12 heures ou plus) ENROBAGE en paraffine : température aussi à 58°C +++

Étalement-Séchage Coupes de 3µ sur Lames spéciales (+système adhésif) bain d’eau distillée à 37- 40°C, décontaminé le soir !!!! ou Sur plaques chauffantes progressives +++ Lames spéciales (+système adhésif) Drainer sur champ à température ambiante Sécher 1h à 58° puis une nuit à 37°+++ dans l’étuve ventilée ( thermomètre de contrôle à l’intérieur)

Microtome dédié et piscine thermostatée et lumineuse

Déparaffinage ++++ Séquence automatisée: Toluène 3 x (5minutes) 15 min Ethanol 100%, 95%, 80% 6 min. Eau déminéralisée 2 min. RENOUVELLEMENT DES BAINS REGULIEREMENT un bain par jour !!

Démasquage au micro-ondes 7000 euros…..!!!! Sinon rien ou bain marie

Les cuves du four micro-ondes

Démasquage au bain-marie 40 minutes à 97°C (thermomètre !!) Puis 20 minutes précises dans le tampon sur la paillasse

Le pH est ajusté à 6.10 +++ par addition de HCl ou NaOH Tampon citrate  à faire soi même  ou tout prêt (chez DAKO par ex) Acide citrique 1mM (solution A) Tris sodium citrate 1mM (solution B) 14 ml de A + 86ml de B + eau distillée qsp 1000ml = solution de travail Le pH est ajusté à 6.10 +++ par addition de HCl ou NaOH

Le pH mètre un investissement indispensable

Anticorps utilisés Polyclonal : grande sensibilité A485 Monoclonal : grande spécificité CB11, SP3 (lapin), Ventana (clone 4B5) Reconnaissant un des domaines externe ou interne de HER2

Pipetage Apprendre à pipeter juste avec des Pipettes contrôlées. Précision, fidélité et justesse!! Maintenance tous les ans (joints d’étanchéité) Au labo : tous les 2 mois par pesées 1000µl = 1gr et 500µl= 0,5g, (trois mesures ) Cônes stériles+++ Précision du pipetage : contrôle visuel lors du pipetage

Dilution La plus élevée possible - pas de marquage des glandes normales Détecter uniquement la surexpression (glandes normales négatives) Étalonnée par rapport à la FISH +++++ Les dilutions sont ajustées en fonction du lot d’anticorps. (annexes exemples FPL )

Prévention des contaminations Utilisation de gants et de matériel à usage unique Utilisation de diluant pour anticorps du commerce (surfactant et bactéricide)

« Aliquotage » Limiter la fréquence des pipetages Les dilutions d’anticorps primaires sont réalisées à distance de la manipulation par un technicien responsable. Chaque lot d’anticorps dilué fait le l’objet d’une vérification du titre Garder la feuille de l’ANTICORPS (n° du LOT à noter sur le flacon ainsi que la date d’ouverture) Préparer les aliquots par ex CB11 NOVOCASTRA : un tube stock aliquoté ajusté en fonction de la dilution que l’on utilise et de la consommation du laboratoire. L’anticorps dilué se conserve moins bien (moins d’1 semaine) Les aliquots sont conservés congelés à -20°C 100µl minimum sinon risque de dessication (>6MOIS)

Tous les réactifs (PBT, PBS…), sont préparés stérilement en dose unique En dehors des produits prêts à l’emploi des automates type Benchmarck, Ventana…

Kits de révélation AC-BIOTINE<>AVIDINE (exemple: ABC de VECTOR, Ventana) Polymères (de dextran; exemple : Envision…)

Regroupement des demandes Pour l’analyse en série (minimum de 10 cas à la fois) Regroupement des techniques HER2 pour des structures avec recrutement plus faible Optimisation du temps technique et préparation des réactifs Introduction de lames témoins externes à chaque manipulation DATER les lames d’une même manip (lot de lames techniquées)

Automatisation de la séquence Autostainer Benchmark Bond max etc...

Avantage de l’automatisation Standardisation Pas de consommable spécifique Ouverture à tout les système détection Intervention possible du technicien en cas de problème Grande capacité

Lames témoins Des coupes multi-tissulaires issues de blocs dont le statut du gène HER2 est connu (FISH) Sinon accessibilité de la FISH (à rechercher auprès des centres de référence ++++) Prendre au minimum des glandes normales et une maladie de PAGET ou un Carcinome in situ de haut grade HER2 +++) Elles sont utilisées dans chaque série analysée Lames datées à chaque manipulation et conservées au laboratoire, accessibles à tous Ne pas couper les lames trop longtemps avant la manipulation (idéalement une semaine avant), à conserver à +4°C à l’abri de la poussière

Choix des zones d’intérêt

Forage des blocs donneurs

Confection du bloc multi-tissulaire témoins externes

Utilisation de témoins Témoin positif de réaction Témoin négatif Glandes normales Témoin positif de réaction Maladie de PAGET

Critères d’interprétation des cas positifs Expression forte Score : 3+ Marquage complet et intense Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène Expression modérée Score : 2+ Vérification du statut du gène/FISH Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène

Feuille de paillasse Un exemple

Commentaires de manipulation et de validation

Dialogue médecins & techniciens TRAVAIL MAIN DANS LA MAIN Feuilles de manip, commentaires de validation des témoins

À l’équipe qui l’a réalisé Et à ceux qui ont bien voulu le relire remerciements À l’équipe qui l’a réalisé Anne Vincent Salomon Institut Curie Paris André Nicolas Institut Curie Paris Jérôme Couturier Institut Curie Paris Matthieu Roche Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Et à ceux qui ont bien voulu le relire Laurent Arnould Centre Georges François Leclerc Dijon Jean-Marc Guinebretière Centre René Hugenin St Cloud Jocelyne Jacquemier Centre Paoli Calmettes Marseille Frédérique Penault Llorca Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Magali Lacroix Centre Claudius Regaud Toulouse Gaetan Mac Grogan, Institut Bergonié Bordeaux

Le statut HER2 ne serait pas stable et pourrait être acquis au cours de l’évolution tumorale Meng S PNAS 2004

Puis même étude sur 24 patientes HER2 - Meng S, PNAS 2004 33 patientes stade I à IV Comparaison de l’amplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER2 -

Etude initiale sur 33 patientes Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou anti HER2 avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives.

24 HER2- Ils ont alors évalué le statut HER2 sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » en rechute. Parmi ces 24 patientes, 9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression Les 9 patientes ont alors reçu un traitement anti HER2: 2RP et une RC

Critiques de l’étude Les niveaux d’amplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. Il est difficile de comprendre pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale. Par ailleurs, pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? Plusieurs hypothèses se discutent : soit le statut HER2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) soit la CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification ; soit la cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection d’un clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale

Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale au niveau des métastases