PAR JEAN CLAUDE KASEREKA Biologiste PNLT/LNRM

INTRODUCTION D’APRES L’OMS, le Mycobacterium tuberculosis est probablement sous diagnostiqué aujourd’hui, en depit de quelque nouveaux cas actifs rapportés dans la region Europe de l’OMS en C’est la consequence directe de methodes actuelles de test de BK, qui exigent des semaines pour fournir un resultat definitif.

SUITE Certains patients ne recoivent donc pas de TTT ou prennent de TTT inefficace. Ces patients peuvent continuer de transmettre le BK à d’autres personnes de la communaute; croissant la charge de la morbidite. Avec la reemergence mondiale de la TBC, les souches multiresistantes (MDR) et ultraresistantes (XDR) sont à present encore menancantes.

SUITE D’apres le GLOBAL TUBERCULOSIS CONTOL REPORT 2009 de l’OMS, il pourrait y avoir plus de cas dans le monde. Les test actuels de sensibilite aux medicaments peuvent prendre plus de 4 semaines, ce qui accroit la mortalité et favorise la dissemination des souches MDR.

SUITE Ainsi la validation par l’OMS du test XPERT MTB/RIF qui detecte sumultanement le BK et la resistance à la rifampicine, avec une haute sensibilité et spécificité pour les échantillons négatifs aux frottis et positifs a la culture, le GENEXPERT MTB/RIF s’avère une solution immediate.

OBJECTIF GENERAL RENFORCEMENT DES CAPACITES DES BIOLOGISTES MEDICAUX ET DES TECHNICIENS DE LABORATOIRE SUR L’UTILISATION DU GENEXPERT MTB/RIF.

OBJECTIFS SPECIFIQUES A l’issue de cet atelier, les participants devraient être capables de : Installer correctement un GenXpert ; Maîtriser l’utilisation et le fonctionnement du test Xpert MTB/RIF ; Maîtriser les indications du test Xpert MTB/RIF ; Installer correctement le logiciel GenXchange et former les utilisateurs ; Reconnaitre les problèmes, les documenter et maitriser les procédures de résolution ad hoc ; Réaliser les maintenances préventives, quotidiennes, hebdomadaires et mensuelles ; Maîtriser le système de gestion des stocks de réactifs et des déchets ; Maîtriser le système de rapportage ; Evaluer le rendement de l’automate Xpert MTB/RIF.

METHODOLOGIE Lecture individuelle de différent documents ; Exposés interactifs ; Discussions, échanges d’expériences Demonstration, Travaux pratiques

DOCUMENTS et MATERIELS DE TRAVAIL Xpert OMS facts sheet ; Manuel Xpert de l’utilisateur ; Notes personnelles Flip chart + marqueurs ; LCD (Vidéo - projection) ; Lap Top ; 1 chevalet + feuilles Flip Chart + feutres.

PERSONNES A FORMER BIOLOGISTES MEDICAUX et TECHNICIENS DE LABORATOIRE DES CSDT DE LA CPLT/KINSHASA

LIEU ET DATE La formation sera effectuee au LNRM du MARDI 22/11 AU VENDREDI 25/11/2016 de 7h30 à 16h00.

AGENDA 1/ INSTALLATION D’UN GENEXPERT, 2/ LE TEST GXPERT MTB/RIF: procedure, 3/ LES INDICATIONS DU TEST GXPERT MTB/RIF, 4/ LE LOGICIEL GENEXCHANGE, 5/ LES PROBLEMES ET LEURS RESOLUTIONS, 6/ LA MAINTENANCE DE LA MACHINE, 7/ LA GESTION DES CARTOUCHES, DES REACTIFS ET DES DECHETS BIOMEDICAUX, 8/ LES OUTILS D’INFORMATION ET SYSTEME DE RAPPORTAGE, 9/ LE RENDEMENT DE L’AUTOMATE GXPERT.

RAPPELS THEORIQUES 1/ La presence de Mycobacterium tuberculosis chez l’homme signe toujours une infection. 2/De la cellule au gene rpoB. 3/ De la ARN polymerase a la Rifampicine. 4/ De la resistance au test GENEXPERT MTB/RIF.

LA PRESENCE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. La presence de Mycobacterium tuberculosis chez l’homme signe toujours une infection. L’apparition des symptomes( 3T et 3A) est la signification de la tuberculose maladie qui est confirmée par la presence des BAAR dans les expectorations pulmonaires et bronchiques du présumé malade.

DE LA CELLULE AU GENE rpoB Les bacteries sont des cellules, elles contiennent donc de l’ADN, des enzymes et une paroi. Les mycobacteries se distinguent d’autres bacteries par: - la paroi mycobacterienne, - les proteines de Mycobacterium tuberculosis, - L’ADN de Mycobacterium tuberculosis.

A/ LA PAROI DES MYCOBACTERIES Concentration importante en acides mycoliques - “ Cire” resistante dans le milieu exterieur; caracteristique mise en profit par la coloration de ZIEHL- NEELSEN et la coloration à l’auramine. - Confère une resistance naturelle à la plupart d’ antibiotiques, - Confere une resistance plus importante au NaOH; caracteristique mise à profit dans les étapes de la decontamination des échantillons avant la mise en culture.

B/ LES PROTEINES DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Il dispose d’un arsenal des proteines qui le rend “ UNIQUE” et pathogène. L’ARN polymerase est presente chez toutes les bacteries mais chaque fois avec de petites differences. Cette proteine permet de transformer l’ADN en ARN messager. Elle est donc une “ pierre angulaire” pour la fabrication de toute autre proteine

C/ L’ADN DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Le Mycobacterium tuberculosis dispose d’une sequence d’ADN qui contient le “code”( ou gene) des toutes les proteines. L’ADN de toutes les bacteries peut muter le plus souvent sans grande consequence. Lorsque ces mutations surviennent dans le gene “ pierre angulaire”, ces mutations sont generalement le plus souvent mortelles pour la bacterie. En consequence ces genes sont generalement bien conserves.

D/ LE GENE rpoB Le gene qui code pour l’ARN polymerase s’ appele “rpoB”. Comme tous les genes, il est compose d’ une sequence de paires de base. Le gene rpoB de Mycobacterium tuberculosis est “unique” car sa sequence est differente des autres bacteries. Lorsque l’on retrouve le gene rpoB dans un prelevement, on peut donc affirmer qu’il y a bien une tuberculose.

3/ DE L’ARN POLYMERASE A LA RIFAMPICINE Vue l’importance de l’ARN polymerase dans la physiologie de toutes les bacteries( pierre angulaire),c’est une bonne cible pour un traitement antibiotique. La rifampicine inhibe l’ARN polymerase de Mycobacterium tuberculosis.

4/ DE LA RESISTANCE AU TEST GENEXPERT a/ La region du gene rpoB liée à la resistance à la rifampicine. - pour etre active, la rifampicine doit s’inserer dans une poche de l’ARN polymerase, elle se fixe alors grace à une serie des ponts. Si une ou plusieurs de ces ponts sont alterés, la rifampicine ne peut plus se fixer et donc ne plus active. b/ Des mutations conferent une resistance à la rifampicine. - Les ponts sont une douzaine d’acides aminés situés a la face interne de la poche

SUITE - Ces acides amines sont codés par 81 paires de bases( 27 codons) situés dans une section bien delimitée du gène rpoB. - Lorsqu’une mutation provoque un changement d’acides amines, le “pont” disparait et la rifampicine ne peut plus se fixer

c/ PRINCIPE DU GENEXPERT MTB/RIF. Recherhe par PCR de la presence des mutations liées a une resistance a la rifampicine. Le test GeneXpert MTB/RIF est basé sur l’analyse par amplification en temps reel et detection par balise moleculaire la presence de mycobacteries du complexe tuberculosis et sa resistance ou sa sensibilite a la rifampicine à partir d’un echantillon clinique. A chaque cycle d’amplification, la quantite d’ADN est mesurée grace à un marqueur fluorescent don’t l’emission est proportionnelle à la quatité d’amplicons produit durant la reaction.

ETAPES DU TEST EXPERT MTB /RIF PREPARATION DE L ECHANTILLON/ EXTRACTION DE L ADN. AMPLIFICATION DETECTION Voir procedure

NATURE DE L ECHANTILLON Les crachats et tous les liquides d épanchement et les liquides de ponction. Sauf le sang et les selles, NB. Eviter les échantillons avec débits alimentaires, Fourmies et toute autre particule solide,

PRINCIPALES TECHNIQUES POUR DETECTER LES MYCOBACTERIES -Microscopie BAAR: Ziehl Neelsen et LED -Culture: solide et liquide, -Biologie moleculaire: PCR, RT-PCR, LIPA

MICROSCOPIE BAAR INDICATIONS: Identification des BAAR a partir des crachats. AVANTAGES: - facile a realiser - rapide, - utilisee en suivie de traitement INCONVENIENTS: - faible sensibilite( bacilles/ml) – non adaptee au patient avec faible charge bacterienne( immunodeprimes) - ne permet pas de differencier le type de mycobacteries

CULTURE INDICATIONS: identification des souches de mycobacteries sur milieu liquide et solide. AVANTAGES: - tres bonne sensibilite( bacilles/ml), -utilisee pour le suivi de traitement, -plus specifique que la microscopie BAAR. INCONVENIENTS: -delai long de rendu des resultats( 8 semaines), - necessite une certaine expertise, - PSM de type II requise -

PCR EXPERT MTB/RIF INDICATIONS: detection de l’ADN du complexe MTB et de la resistance a la rifampicine. AVANTAGES: - plus simple a realiser, - plus rapide(-2hoo) -plus sensible INCONVENIENTS: - cout eleve de la machine

EN RESUME TECHNIQUESMICROSCOPIECULTUREEXPERT MTB/RIF SIMPLICITE OUI NON OUI SENSIBILITE MAUVAISE EXCELLENTE DELAI 1H 6-8 SEMAINES 1H52 COMMENTAIREFAUX NEGATIFS FREQUENT LONGUE ENTIEREMENT AUTOMATISE

INSTALLATION D’UN GXPERT CONDITIONS D’INSTALLATION: -Piece bien ventilee, -Temperature controlee entre 15 à 30 c) - Pas directement sous la climatisation ou pres d’une fenetre ou au soleil, - Table solide et stable, pas de centrifugieuse pres du systeme, - Laisser cm de degagement de chaque cote de l’instument, - Proche d’une prise de courant

INDICATEURS DU TEST GXPERT MTB/RIF OMS - Test de diagnostic ou complementaire en cas de suspicion de la tuberculose pulmonaire MR ou de tuberculose associee au VIH, - -Test de diagnostic initial ou complementaire en cas de suspision de meningite tuberculeuse, - - Test de diagnostic initial et complementaire en cas de suspicion de tuberculose extrapulmonaire. PNLT -Populations vulnerable: prisonniers, miniers,enfants, deplaces…

RESOLUTIONS D’ERREURS QUE faire en cas de problemes: 1/ En cas d’erreurs, un message apparait a l’ecran souvent avec un code d’erreur, 2/verifier si le probleme affecte le module en particulier, 3/regarder dans le manuel d’utilisation du Gxpert, le code d’erreur et suivre les mesures correctives recommandees, 4/Si le probleme persiste, contacter le IT local.

SITUATIONS PLUS COMMUNES Genexpert ou modules non detectes, Problemes sans code d’erreurs: -Non valide: resultat invalide, -Pas de resultat: test interrompu, -Cartouche bloquee dans le module Problemes avec codes d’erreurs: - Erreurs liees a la temperature: codes 1001,1002, 2014, 4009, 4017,2032, - Erreur de la verification des sondes: codes 5006, 5007, - problemes de pression de la seringue: code 2008, - -perte de communication: code 2120,2122, 2124, - -perte de signal (fluorescence) : code 5011

MAINTENANCE DE LA MACHINE Maintenance preventive: -a realiser regulierement par l’utilisateur, - taches quotidiennes, hebdomadaires, mensuelles, annuelles, - assurent la performance optimale du systeme, Permettent des defaillances et des erreurs.

MAINTENANCE QUOTIDIENNE 1/ Nettoyage de la surface de travail 2/ Retirer et jeter les cartouches usagees, 3/Fermer les portes des modules

MAINTENANCE HEBDOMADAIRE 1/ Etendre l’ordonateur, 2/ Eteindre le Genexpert, 3/ Attendre 10 secondes, 4/ Rallumer le Genexpert, 5/ Rallumer l’ordinateur NB: Lorsque le Gxpert n’est pas utilise, l’eteindre et le couvrir avec la housse plastique fournie avec la machine.

MAINTENANCE MENSUELLE 1/ Nettoyer les surfaces exterieures, 2/ Nettoyer les surfaces internes des modules, 3/ Nettoyer les plongeurs, 4/ Nettoyer les encoches des modules, 5/ Nettoyer les filtres du ventilateur, 6/ Archiver les donnees. NB: Fiche de maintenance en jour.

MAINTENANCE ANNUELLE ou XPERT CHECK Tous le s modules doivent etre controles chaque annee pour garantir leur performance.

RENDEMENT DE L’ AUTOMATE GXPERT Le rendement sera analyser de la maniere suivante: - Le niveau d’activite du laboratoire cad le nombre des test par module par jour, - Le pourcentage de tests non valides par module cad erreur, invalide, non result, - Le nombre de cas depistes cad Rif/s, Rif/ind., Rif/R.

ALGORYTHME A SUIVRE

MERCI