. De la mécano-perception du peuplier à la sensibilité colique chez la souris Rôle du facteur de transcription EGR-4? Alison ACCARIE, Emilie MULLER, Alain ESCHALIER, Agathe GELOT, Denis ARDID INSERM, UMR 1107 Neurodol, Laboratoire de pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur, Université d’Auvergne, Clermont-Ferrand, France. I NTRODUCTION M ATÉRIELS & M ÉTHODES Animaux : souris C57Bl/6J mâles, wt n’ayant subit aucune stimulation Tissus prélevés : Côlon (dans sa partie terminale), DRG viscéraux (T10-13, L6 et S1) et moelle épinière. Immunohistochimie : Les DRGv et la moelle épinière sont inclus en paraffine puis coupés au microtome en coupes de 7 µm. les tissus sont déparaffinés puis réhydratés, saturés avec du TBS-tween 0,1% et 5 % de sérum d’âne pendant 1 heure. Après prélèvement, le colon est ouvert, Le côlon après son prélèvement est ouvert, étalé sur une gélose puis recouvert de PFA 4% toute une nuit. On le rince ensuite avec du PBS 1X puis on sépare les 4 principales couches (« Whole Mount »): la muqueuse, la sous- muqueuse, les couches musculaires et les plexus myentérique. On ne garde, pour l’immunohistochimie, que les plexus myentériques. Les tissus sont perméabilisés et saturés avec une solution de PBS triton 1% sérum d’âne 4% pendant 1h. Incubation avec l’anticorps primaire toute la nuit dilué au 1/500 ème pour EGR-4 (sc ) et au 1/1000 ème pour PGP9.5 et CGRP. L’anticorps secondaire est déposé le lendemain à la concentration de 1/1000 ème pendant 2 heures. Les lames sont montées avec du milieu de montage pour fluorescence. Western Blot : Les tissus sont broyés et les protéines extraites. Dépôt de 50 µg de protéines dans un gel d’agarose 10%. Transfert sur membrane PVDF, saturation avec une solution de TBS-T et régilait 5 %. L’anticorps primaire est mis pendant la nuit à 4°C au 1/1000 ème. Le lendemain l’anticorps secondaire est déposé à la concentration de 1/1000 ème. Révélation avec le kit ECL qPCR : Extraction des ARNm du colon au Trizol, dosage des ARN, vérification de l’intégrité et de la quantité par gel d’agarose. Utilisation du protocole invitrogen superscript II pour la reverse transcription, qPCR avec amorces forward 5’ CTCCAACCTGAGCGACTTCTC 3’ et reverse 5’ TGCCAGACATGAGGTTGAG 3’. UMR 1107 C ONCLUSIONS R ÉSULTATS Dans un contexte physiopathologique tel que les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin ou le syndrome de l’intestin irritable, la perception des stimuli mécaniques au niveau colique peut se trouver altérée et donner lieu à une hypersensibilité colique. Les mécanismes et les senseurs impliqués dans la perception de ces stimuli mécaniques au niveau viscéral sont à ce jour encore mal connus. La perception des stimuli mécaniques est commune à beaucoup d’espèces qu’elles soient animales ou végétales. Dans un premier temps l’équipe MECA de l’UMR PIAF a identifié un facteur de transcription impliqué dans la mécano- perception chez le peuplier (Martin, 2009) puis, après des analyses phylogénétiques, un équivalent génique a été trouvé chez la souris : EGR-4 (ou NGF1-C). Une étude menée chez la souris a montré une augmentation de son transcrit dans le cortex somato-sensoriel suite à une stimulation des vibrisses (Mark, 1995). Aucune étude à ce jour ne s’est intéressée à l’implication de ce facteur dans la mécano-perception au niveau viscéral chez l’animal. Notre travail a donc consisté à étudier la localisation de ce facteur dans les différents organes impliqués par la mécano- perception viscérale et sa possible modulation au niveau de l’organe cible, le colon, et du premier relais d’intégration du message douloureux, le ganglion dorsal rachidien (DRG), suite à une stimulation mécanique, la distension colorectale. Colon Western Blot Moelle épinière EGR-4 Immunohistochimie paraffine qPCR X 40 X 20 Coloc Immunohistochimie Whole mount EGR-4 X 20 PGP9.5 X 20 Coloc DRGv EGR-4 CGRP Immunohistochimie paraffine Outils validés pour ces deux techniques. Expression basale ARNm et protéine EGR-4 dans le colon. Expression EGR-4 dans les plexus myentériques et fibres musculaires lisses coliques. Expression EGR-4 dans les neurones peptidergiques des DRGv. Expression EGR-4 dans les neurone de la corne dorsale KD Immunohistochimie paraffine EGR-4 x40 PGP9.5 x40 Coloc coloc X 40 X 20 Validation des outils qPCR, WB et IHC pour EGR-4. EGR-4 est exprimé dans le colon et les tissus impliqués dans les premiers relais de la perception mécanique colique. EGR-4 semble être une cible intéressante pour l’étude des mécanismes liés à l’hypersensibilité viscérale. X pb 200 pb