OPTION EQUINE II – SYSTEME DIGESTIF 1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES 2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE Annick Linden Service de Bactériologie Dpt. des Maladies Infectieuses et Parasitaires

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né 2. Poulain 3. Adulte 4. Diarrhées induites par les ATB

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né - E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain - Salmonella sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte - Salmonella sp - Clostridiose - Colitis "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

CAUSES INFECTIEUSES RESPONSABLES DE MORT BRUTALE (< 24 H) CHEZ LE CHEVAL Shaker-foal syndrome Clostridium botulinum (type B) Hépatite chez le poulain Clostridium piliforme (Tyzzer’s disease) Septicémies néonatales Actinobacillus equuli E coli, Salmonella sp Septicémies chez l’adulte Bacillus anthracis, … Entérotoxémies Clostr perfringens, difficile, sordellii Myopathies d’origine clostridienne Clostr septicum, chauvoei, novyi,perf, Colite aiguë et csq Neo risticii, Salmonella sp Colitis « X » Clostridium sp Hémorragie poches gutturales Mycose

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES Nv-né - Septicémie : E coli, Actinob. sp, Salm - Clostridium sp 1 – Actinobacillus equuli " Maladie du poulain triste " (avt : Shigellose du poulain) Changements récents dans la taxonomie Actinobacillus equuli subsp equuli Actinobacillus equuli subsp haemolyticus (taxon 11 de Bisgaard) Coccobacilles Gram nég, aéro-anaérobies coloration bipolaire, immobiles, non sporulés gélose au sang, 5 % CO2 A equuli equuli : col visqueuses, adhérentes, non hémo A equuli haemolyticus : hémolytiques

Actinobacillus equuli equuli Bactéries commensales muqeuses (Resp et Dig) des chevaux ---- Pathogènes opportunistes Souches flore normale = Souches isolées de lésions A. equuli equuli : Cv (poulain, adulte), porc A. equuli haemolyticus : que chez les chevaux (poulain, adulte) Actinobacillus sp

Contexte de septicémie : transfert immunité passive ? Début brusque : 24-48 H Poulain fort abattu, refuse de têter Fièvre n’est pas constante Diarrhée et troubles respiratoires Articulations douloureuses Arthrites fréquentes si survie Tableau parfois discret (cfr MIGA) : diagnostic précoce difficile Septicémies néonatales chez le poulain : Actinobacillus sp est une cause de mortalité fréquente Actinobacillus sp

DIAGNOSTIC ANTE MORTEM Diagnostic précoce = ttm précoce = meilleur pronostic Clinique « Score septique » : WBC, fibrinogène, glycémie, IgG Hémocultures : OK en théorie mais : matériel adéquat plusieurs hémocultures nécessaires/24h risque de faux négatifs interprétation des résultats 24 - 48H pour avoir les résultats DIAGNOSTIC POST MORTEM Lésions macro Prélèvements de choix : reins, poumons Diagnostic précis : confusion possible avec Pasteurella Actinobacillus sp

Traitement (Actinobacillus sp) Péni-Genta TMP/S Céphalosporines III G Etude en Suède 97 % des souches Act sensibles à TMP/S 92 % Ampi 90 % Péni 85 % Genta 49 % Strepto Prévention Pas de vaccins commerciaux Mesures d'hygiène (accouchement), colostrum ! Actinobacillus sp

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né - E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain - Salmonella sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte - Salmonella sp * - Clostridiose * - Colitite "X" - Potomac Horse Fever * Diarrhées induites par les ATB

2 - Clostridium sp Sphère Digestive Clostridium tetani Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium sordellii Clostridium difficile Clostridium cadaveris Sphère Digestive

Clostridium perfringens Bâtonnets réguliers Gram +, anaérobies, sporulés Toxines majeures a b1 b2 e i Toxines mineures

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Photos

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Photos

Clostridium perfringens a b1 e i entérotoxine A + - +/- B ++ C D E Poulain : toxinotypes B et C Adulte : toxinotype A

5 DIFFERENT TOXINOTYPES a b e i A + - B C D E MAJOR TOXINS d q k l m N n h g he Ent - + MINOR TOXINS VEGETATIVE PHASE SPORULATION PHASE

TOXINS C. SEPTICUM C. SORDELLII C. PERFRINGENS C. DIFFICILE DIGESTIVE TRACT

Clostridium sp chez le poulain (1) C. perfringens Type B et C surtout (toxine b sensible à la trypsine) Susceptibilité du nv-né (absence de protéases intestinales et inhibiteur de trypsine dans colostrum) Sporadique sauf exception Poulain de 1 ou 2 jours Soit mort brutale Soit signes systémiques, diarrhée hémorragique et mort en 2 J Diagnostic lésionnel : entérite hémorragique nécrosante bactériologique : aspect quantitatif ! Traitement (cibler surtout déshydratation) Si ATB: métronidazole (cfr législation), Péni Probiotiques (compétition de flore : Clostr versus Lactobacillus sp)

TOXINOTYPE C (a, b) IN NEWBORN ANIMALS Photos

TOXINOTYPE C (a, b) IN NEWBORN ANIMALS ABSENCE O b TOXIN TRYPSIN SENSITIVE (anti-trypsin activity in colostrum) ABSENCE OF NORMAL INTESTINAL FLORA BRUTAL DIET CHANGES ARE RISK FACTORS

TOXINOTYPE C : a, b + MINOR TOXINS Photo ENTERITIS NECROTICANS IN HUMAN

Clostridium sp chez le poulain (2) C. difficile chez des poulains avec/sans ATB poulains de 3 à 5 jours, cas mortels entérite hémorragique nécrosante mise en culture délicate, milieux spécifiques Larges bâtonnets à Gram +, anaérobies stricts, svt mobiles Spores subterminales, ovales et déformantes Bactérie ubiquitaire sols, eaux, flore intestinale, … milieu hospitalier : spores !! désinfectants à base d’hypochlorite TOXINES Toxine A (entérotoxine) : cfr diagnostic Toxine B (cytotoxine) Toxine binaire

Clostridium sp chez le poulain (2) C. difficile Nombreux poulains ( < 14 J) sont porteurs de Clostridium difficile !

Clostridium sp chez l'adulte 1. Clostridiose intestinale Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB ..) Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo) Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines 2. 3.

a TOXIN = PHOSPHOLIPASE C ATTACKS CELLS MEMBRANE CELL DEATH erythrocytes, platelets, leukocytes, endothelial and muscle cells, …

a toxin Photos

A NOVEL TOXIN : B2 TOXIN POUR INFO …… NECROTIC ENTERITIS IN PIGLETS (GIBERT ET AL. 1997) b2 PURIFIED FROM C. PERF TYPE C Photos

B2 TOXIN PROTEIC MAJOR EXOTOXIN (265 Aa, 28 kDa) LETHAL FOR MICE AND TOXIC FOR CELLS IN CULTURE APPARENT PROTEIN INSTABILITY Cpb2 GENE IS PLASMIDIC (MOBILITY) C. PERF TYPE A (++), C, D, E, (B)

CAUSE-AND-EFFECT RELATIONSHIP ?? GENE IS PRESENT BUT TOXIN ?? Cpb2-POSITIVE STRAINS (C.PERF TYPE A) ASSOCIATED WITH ENTERITIS : IN PIGLETS (GARMORY ET AL, 2000) IN HORSES (HERHOLZ ET AL, 1999) IN DOGS (THIEDE ET AL, 2001) IN CATTLE ….IN ELEPHANT (BACCIARNI ET AL, 2001) CAUSE-AND-EFFECT RELATIONSHIP ?? GENE IS PRESENT BUT TOXIN ??

PIGS OK HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN NEONATAL PIGS WITH ENTERITIS (91.8% VERSUS 11.1 % FROM HEALTHY PIGS) AND HIGH CORRELATION OF GENOTYPE WITH PHENOTYPE (> 96.9%) (BUESCHEL ET AL, 2003) HORSES HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN HORSES WITH TYPHLOCOLITIS (HERHOLZ ET AL, 1999) GENOTYPE/PHENOTYPE ? IMMUNOHISTOCHEMISTRY NEEDS FURTHER INVESTIGATION (BACCIARINI ET AL, 2003)

Clostridium sp chez l'adulte 1. Clostridiose intestinale Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB ..) Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo) Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines 2. Colite "X" Etiologie non déterminée Forte suspicion d'implication des Clostridies (entérotoxémie) Fort semblable au tableau de clostridiose mais évolution plus rapide Pronostic négatif 3. Clostridiose ATB – induite C. perfringens, C. difficile

Clostridium sp chez l'adulte Cas particulier de Clostridium difficile Médecine humaine : principale cause de diarrhée post ATB infection nosocomiale (spores en milieu hospitalier !) Médecine équine : importance croissante de C. difficile ( diagn ++)

Clostridium sp chez l'adulte Clostridium difficile Médecine équine : thèse V. Baverud (Suède, 2002) (1) Colites aiguës et fatales chez cv adultes groupes à risque : cv hospitalisés et traités ATB juments dont poulains traités erythro/rif (2) Exp. Erythromycine induit colite sévère avec prolifération de C.difficile (3) Portage fréquent de C. difficile chez des poulains sains (<15J) réservoirs ? (4) Milieu ext : fermes d’élevage > centres d’entrainement

Clostridium sp chez l'adulte Clostridiose ATB – induite Cas particulier de Clostridium difficile Clinique : coliques, diarrhée parfois hémorragique, déshydratation Diarrhée peut débuter pdt ATB ttm ou qques J après Prudence si cas de diarrhée : envrnmt contaminé +++ Lésions : entérite hémorragique nécrosante Diagnostic : prélèvements répétés de MF (1) Mise en culture rapide, milieu sélectif CCFA (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar) (2) Détection toxine : conserver MF à 4°C car dénaturation rapide kits commerciaux Traitement : Métronidazole reste ATB de choix

Diagnostic Clinique : Clostridies : diarrhée (+/-) Bactériologique toxémie Bactériologique Anaérobiose Milieux sélectifs Comptages !! si post mortem : délai minimum entre mort de l'animal – prélèvement et mise en culture

CLOSTRIDIUM PERF IN HORSES MANAGEMENT IMPROVEMENT SHIFT OF INTESTINAL FLORA RISK FACTORS

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né - E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain - Salmonella sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte - Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

3 - Salmonella sp Réceptivité : poulain nv-né, poulain sevré et adulte Importance des facteurs favorisants Infection nosocomiale Certains sérovars prédominent dans un envrnmt donné Problématique des porteurs asymptomatiques Emergence rapide de souches ATBrésistantes Résistance des Salmonella dans le milieu extérieur !! CONDITIONS D'HYGIENE

Salmonellose équine Septicémie Entérite aiguë Entérite chronique

Caractéristiques Nomenclature des Salmonelles ! Une seule espèce : Salmonella choleraesuis 7 sous-espèces dont S. choleraesuis subsp choleraesuis Nombreux sérovars ( > 2200) : Ag O, Ag H (et Ag Vi) Sérovars les plus fréquents chez le cheval : S. typhimurium, S. hadar, S. anatum, S. agona, S. newport, .. ( nomenclature en raccourci !) Coccobacilles Gram nég, mobiles, Aérobie, cat +, O/F : F Gassner +, fermentation lactose -, Ox - Milieux d'enrichissement (tétrathionate), 42 °C Tests d'agglutination rapide sur lame Galeries biochimiques de confirmation, PCR

Facteurs favorisants à haut risque : Milieux hospitaliers ! Environnement contaminé sol ( 1 an), crottins séchés ( > 2,5 ans !), eau ( > 9 mois) Dose infectante Stress ATB (dérive de flore) Virulence de la souche Statut immun à haut risque : Milieux hospitaliers !

Clinique – forme gastro-intestinale cfr cours MIGA Souvent 1 à 2 jours avant diarrhée : Abattement – anorexie – et sy associés à l'endotoxémie Hyperthermie ++++ Episodes de coliques – constipation Diarrhée : profuse, liquide, malodorante, pfs hgique Déshydratation rapide Tableau variable depuis entérite légère à mortelle Diarrhée peut durer plusieurs semaines Passage à chronicité possible

Lésions Ulcères gastriques (infarcti veineux – toxine) Typhlo-colite aiguë, hémorragique, pseudomembraneuse foyers nécrotiques foie – rate Infarcti niveau colon (cfr prolapsus rectal)

Diagnostic Clinique : CV diarrhée aiguë ou chronique : toujours effectuer une recherche Salmonella Bactériologique ( ante mortem ) Prélèvement précoce (Salm ++ avant diarrhée) Prélever dans le rectum (raclage de muqueuse rectale) Biopsie rectale possible si Mat féc négatives Conserver au frigo – 2 à 3 jours OK Multiplier les prélèvements ! Ne jamais conclure sur base d'un seul résultat négatif Prévenir le labo d'une demande Salmonella Conseillé : 5 prélèvements à 1 jour d'intervalle

Diagnostic Clinique Bactériologique ( post mortem ) Caecum, colon, iléon (contenu et contenant) Ganglions mésentériques

Traitement Pronostic Fluidothérapie = N°1 ATBthérapie : controversée ! AINS Si ATBthérapie décidée : TMP/S, Ampi, AG, Céph ATBrésistances fréquentes et émergence rapide (plasmides) toujours réaliser un ATBgramme cfr rapports du CERVA Pronostic

Prévention et contrôle Cv infectés en zone d'isolement Conditions d'hygiène +++++ Bottes, tabliers, matériel, ...! Salmonella résistent à la dessication Nettoyer (eau chaude sous pression) aussi important que désinfecter (ammonium 4°, crésol), fumigation, Attention débris organiques dans pédiluves Porteurs asymptomatiques (10 à 20 % des cv) Excréteurs actifs (plusieurs semaines après guérison) conseillé : 5 cultures fécales négatives pour affirmer que le cv n'est plus excréteur actif

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né - E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain - Salmonella sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte - Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

4 - Rhodococcus equi chez le poulain forme gastro-intestinale de rhodococcose associée ou non à la forme pulmonaire douleur abdominale, perte de poids, diarrhée isolement de Rh equi dans M féc : pas un indice de diagnostic déterminer virulence des souches (plasmide de virulence) cfr diagnostic et ttm de la forme pulmonaire 5 - E coli (cfr septicémie) 6 - Campylobacter : rôle controversé 7 - Streptococcus durans 8 - Bacteroides fragilis

DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né - E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain - Salmonella sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte - Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

9 - Potomac horse fever Neorickettsia risticii (ancien nom : Ehrlichia risticii) Fièvre équine du Potomac (Rivière dans le Maryland, USA) Identifiée en Am Nord et certains pays Am Sud, suspectéee en Europe Postulat de Koch rempli Transmission via ingestion de trématodes infectés (hypothèse) Localisation intracellulaire (monocytes, macrophages, cellules épithéliales intestinales) fièvre, anorexie, oedème des membres, fourbures très fréquentes typhlocolite et diarrhée (sévérité variable) avortements possibles taux de mortalité jusqu'à 30 % diagnostic sérologique en routine aux USA traitement : tétracyclines (!) Vaccins inactivés disponibles aux USA (efficacité discutable à cause de l'hétérogénéité des souches)

OPTION EQUINE II – SYSTEME DIGESTIF 1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES 2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE Annick Linden Service de Bactériologie Dptmt des Maladies Infectieuses et Parasitaires

Flore intestinale chez le cheval Lactobacillus Aerococcus spp Salmonella spp Eubacterium spp Streptococcus spp E coli Propionibacterium Veillonella Enterococcus spp Bacteroides spp Clostridium spp Staphylococcus spp Rhodococcus spp E coli Salmonella spp Clostridium perfringens Streptococcus spp et Enterococcus spp

1. SAMPLING PROCEDURES : ANTE – POST MORTEM 2. BACTERIOLOGIC ANALYSIS DIRECT SMEARS QUALITATIVE APPROACH QUANTITATIVE APPROACH (Clostr)

1. DIRECT SMEARS (SHIFT OF THE FLORA ?) Photo

Bacterio 2 - Approche qualitative Aérobiose Anaérobiose 80%N2 – 10%CO2 – 10% H2 Confirmation d’identité Columbia Agar 5% sheep blood Gassner Enrichissement tétrathionate Agar au sang sans ATB Agar au sang + polymyxine B Agar au sang + cyclosérine - Galeries biochimiques API 20E et Rapid ID32A

Bacterio 3 - Approche quantitative – Clostridium sp Matières fécales Dilutions successives (10-1 à 10-6) Ensemencement Incubation (aérobiose et anaérobiose) Dénombrement des colonies cv > 103 CFU/ml contenu intestinal bv > 106 CFU . . . . . . . . . . . . . . . .

Photo étuve anaérobique

TO THE LAB WITHIN A FEW HOURS SAMPLING PROCEDURES CLOSTRIDIUM PERFRINGENS - LIGATED INTESTINAL PORTION (20 CM) AS SOON AS POSSIBLE TO THE LAB, ON WET ICE FREEZING IS AN ALTERNATIVE BUT NOT IDEAL Photo TO THE LAB WITHIN A FEW HOURS

ABNORMAL COUNT IF > 103 CFU C. PERF/ ML OF INT CONTENT QUANTITATIVE APPROACH ( C. PERF) CULTURES IN ANAEROBIC CHAMBERS OR JARES COUNTS OF CFU ( BY SERIAL DILUTIONS ) Interpretations must be taken with caution IN HORSE : ABNORMAL COUNT IF > 103 CFU C. PERF/ ML OF INT CONTENT

QUALITATIVE APPROACH ( C. PERF) IDENTIFICATION OF THE BACTERIA IDENTIFICATION OF THE TOXINS INVOLVED 1. TOXIN DETECTION - FROM GUT CONTENTS OR CULTURE SUPERNATANTS - IN VIVO TESTS - ENZYME IMMUNOASSAYS (COMMERCIAL KITS) - LABILITY OF TOXINS 2. GENE DETECTION - MULTIPLEX PCR - GENOTYPE VERSUS PHENOTYPE ?

ENTEROTOXEMIA DIAGNOSIS IDEAL SITUATION SUDDEN DEATH ACUTE HEMORRHAGIC SEGMENTAL ENTERITIS BACTERIAL QUANTITATION WITHIN A FEW HOURS COUNTS > 10 3 CFU/ML ( HORSE ) TOXIN DETECTION ( ELISA AND PCR) DIAGNOSTIC IN A GLOBAL APPROACH

Photo entérite hémorragique segmentaire

Photos

En bref .......et tout système confondu 1 - Lawsonia intracellularis 2 - Clostridium piliforme 3 - Taylorella equigenitalis

1 - Lawsonia intracellularis (pour information) Bacille Gram nég, acido-résistant, non sporulé cultivable sur cellules intestinales de rat in vivo, dans le cytoplasme apical des entérocytes responsable des entérites prolifératives du porc décrit également chez le cheval Diagnostic : - Histopathologie : coloration de Warthin-Starry - Immunofluorescence et PCR (muqueuse iléon)

2 - Maladie de Tyzzer – Clostridium piliforme Hépatite chez le poulain - premières semaines de vie Clostridium piliforme ( ancnmt : Bacillus piliformis) Bacille intracellulaire, sporulé, non cultivable sur milieux inertes Tableau variable : fièvre, dépression, anorexie, ictère, diarrhée, .. Souvent poulains trouvés morts sans signes prémonitoires Transmission féco-orale : ingestion de spores Hépatite nécrosante multifocale Diagnostic histopathologique : coloration de Warthin-Starry Traitement décevant (Pén, Erythromycine)

3 - Métrite contagieuse équine – Taylorella equigenitalis Liste B de l'OIE Infection sexuellement transmissible Etalon: porteur asymptomatique (fourreau, fosse urétrale, urètre, sperme) Jument : endométrite (formes chroniques csq fécondité) Importance économique, entrave aux échanges commerciaux Coccobacille à Gram nég, non sporulé, micro-aérophile Conditions optimales de culture ( gélose chocolat, 7 % CO2) Diagnostic – Ecouvillons pour bactéries anaérobies (AMIES charbon)!! Mesures réglementaires concernant techniques d'écouvillonnage (cfr sites précis de prélèvmt) et modalités de mise en culture. Ecouvillons transmis au labo (agréé) dans les 24 heures !

merci de votre attention