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Techniques d’étude des interactions protéine-protéine à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1002 – hiver 2013

Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ? beaucoup de matériel à disposition focus sur l’étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes ≈5 partenaires pour chaque protéine importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel  interactome

De nombreuses techniques d’étude Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo maintien du contexte cellulaire in vitro caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie …) validation des résultats in vivo

Co-immunoprécipitation http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F

Double hybride Principe : utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure domaine d’activation domaine de liaison à l’ADN fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

Fusion protéines et modules du facteur de transcription Double hybride Système rapporteur DA : domaine d’activation DL : domaine de liaison à l’ADN DA TF DL colonies de levures pas d’expression expression du gène mARN DA DL prot 1 prot 2 prot 3 Fusion protéines et modules du facteur de transcription mARN Expression du système

Double hybride Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246. Avantages : expérience facile à mettre en place Inconvénients : analyse qualitative faux positifs si les interactions préexistent chez la levure faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Application : identification des interactions criblage de banque de protéines

Interactome chez Caenorhabditis elegans Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

PCA : protein fragment complementation assay Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344 Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Principe : rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

PCA : protein fragment complementation assay Avantages : applicable pour les protéines membranaires réponse très rapide niveau d’expression naturel Inconvénients : décalage temporel de la réponse au signal d’expression création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Application : identification des interactions étude des réseaux d’interaction

FRET (fluorescence resonance energy transfer) L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846 R0 10-70 Å excitation nm émission accepteur 475 nm 525 nm donneur 475 525 Principe : excitation d’un fluorophore donneur par un photon émission fluorescence par le donneur excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche mesure du rapport de fluorescence

FRET (fluorescence resonance energy transfer) Avantages : étude dynamique en temps réel applicable in vivo dans le système cellulaire originel peut être couplé à un signal biologique applicable dans tous les compartiments cellulaires Inconvénients : création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nécessite la surexpression des protéines testées Application : signification biologique des interactions localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Principe : 1. peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase 2. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants clivage du tag par la protéase fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase élution du complexe et analyses subséquentes 3. 4. 5. Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

Spectrométrie de masse Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21 Inconvénients : nécessite la purification des complexes méthode compliquée et relativement coûteuse Application : identification des protéines présentes dans un complexe

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Avantages : seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe taux d’expression biologique des protéines identification de complexes avec plus de 2 protéines Inconvénients : seules les interactions très stables peuvent être détectées nombreux faux positifs (protéines « colle ») Application : identification des complexes protéiques

Arbre = réseau connexe non cyclique Quelques définitions Arbre = réseau connexe non cyclique noeud branche Réseau connexe non cyclique Réseau non connexe non cyclique Réseau connexe cyclique

Jeong et al, Nature 2001

Qualité du réseau d’interactions Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes méthodes Pourquoi ? Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.) Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs) Nécessité de valider les résultats

Qualité du réseau d’interactions Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement 10 907 interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae (http://mips.gsf.de/proj/yeast/catalogues/complexes/index.html) Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Qualité du réseau d’interactions Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

http://string.embl.de/ Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437

Distance et Distance caractéristique d’un réseau la distance d(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v la distance caractéristique L = meanu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds http://mathworld.wolfram.com/GraphDistance.html

Diamètre d’un réseau 3 4 5 7 le diamètre D = maxu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits http://mathworld.wolfram.com/GraphDiameter.html

Réseaux « Small-World » dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud v ex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6) ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles http://en.wikipedia.org/wiki/Small-world_network

Connectivité d’un réseau la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau http://web.hamline.edu/~lcopes/SciMathMN/concepts/cevcon.html

Connectivité d’un noeud la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i Exponential Scale-free HUB Jeong et al, Nature 2000

Une autre représentation du réseau 6 3 7 4 8 2 5 1 9

Après un algorithme de clustering 6 3 7 4 8 2 5 1 9

Modular organization of cellular networks 1 P - polarity R - Ras related pathway H - Highly osmotic conditions M - Mating/filamentation Rives AW et al. PNAS, 2003

Modular organization of cellular networks - Modules - Intermodular connections Rives AW et al. PNAS, 2003

Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Recherche de modules A(i,j) : indice de socio-affinité ni;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée : nombre of proies récupérées quand i est un appât : nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts. Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Essentialité des gènes Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

Essentialité des gènes Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

Robustesse du réseau aux mutations Jeong et al, Nature 2000

Robustesse du réseau aux mutations Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518

Perspectives : combiner les réseaux Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology  23:561-566