UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique

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Transcription de la présentation:

UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique CYTOGÉNÉTIQUE CLINIQUE CHEZ LES ANIMAUX D’ÉLEVAGE : BILAN DE LA PLATEFORME DE L’UMR INRA/INPT GENPHYSE ATC le 10/09/2014

Présentation de l’INRA Plan : Introduction : Présentation de l’INRA Présentation du département de Génétique Animale Présentation de la plateforme La cytogénétique clinique à l’INRA Bref historique Les principaux résultats Activité cytogénétique porcine Historique Motivations Principaux résultats ATC le 10/09/2014

Analyse des produits méiotiques Analyse du processus méiotique Activités de recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction Analyse des produits méiotiques Analyse du processus méiotique Nouveaux projets : Analyse de la recombinaison and interférence Analyse de l’infertilité mâle Etude des points de cassure ATC le 10/09/2014

UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique INTRODUCTION ATC le 10/09/2014

L’INRA : L’INRA est un organisme de recherche en agronomie fondé en 1946, placé sous le statut et sous la double tutelle des ministères de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et du ministère de l'Agriculture, de l'Agroalimentaire et de la Forêt. L'INRA mène des recherches finalisées pour une alimentation saine et de qualité, pour une agriculture durable et compétitive, et pour un environnement préservé et valorisé. ATC le 10/09/2014

Le département de Génétique Animale : CT1 - le génome : structure fine et organisation fonctionnelle CT2 - l'animal : leviers génétiques pour un élevage innovant et durable CT3 - les populations animales : caractérisation, gestion et optimisation Equipe CYTOGENE : Plasticité du génome et de l’épigénome au cours de la gamétogenèse Architecture nucléaire 3D et expression du génome Caractérisation de la diversité génétique de l’abeille domestique ATC le 10/09/2014

PLATEFORME DE CYTOGENETIQUE (ISO 9001) Anne Marie LOUSTAU Responsable Qualité AI Inra Nathalie MOUNEY Resp Activité Bovins, autres espèces TR Envt Anne CALGARO Resp Activité Porcs TR Ex Envt Alain PINTON Responsable Plateforme de Cytogénétique IR Inra Nathalie PRONO Secrétaire AJT FR Envt Nicolas MARY TR Inra Alain DUCOS Pr Envt CONTRÔLE CHROMOSOMIQUE DES POPULATIONS ANIMALES (porcs, bovins, chevaux, sangliers…) PROGRAMMES SCIENTIFIQUES Anomalies chromosomiques et reproduction Personnes impliquées dans les deux activités PLATEFORME DE CYTOGENETIQUE (ISO 9001) Périmètre de certification ISO 9001 Harmonie BARASC IE ENVT http://www.envt.fr/node/327 ATC le 10/09/2014

Missions Mission 1 : Contrôle chromosomique des populations animales Apporter un service au monde de l’élevage par la recherche d’anomalies chromosomiques susceptibles d’avoir des répercussions sur la « qualité des reproducteurs » Mission 2 : Programmes scientifiques « cytogénétique et reproduction » Développer, dans la continuité de l’activité de contrôle, des programmes de recherche originaux dans le domaine de la « biologie de la reproduction » ATC le 10/09/2014

Missions Recherches “finalisées ” Objectifs : Estimer les effets potentiels des anomalies chromosomiques Recherches “académiques” Objectifs : Apport de nouvelles connaissances sur le processus de méiose en présence d’anomalies chromosomiques et recherche des causes d’infertilité « mâle » ATC le 10/09/2014

La cytogénétique clinique à l’INRA UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique La cytogénétique clinique à l’INRA ATC le 10/09/2014 ATC le 10/09/2014

Début de la cytogénétique animale dans les années 60 Un peu d’histoire: Début de la cytogénétique animale dans les années 60 1964 : identification de la Rob 1/29 (bovin) et de la première translocation réciproque chez le porc Dans les années 70 développement des techniques de banding et établissement des premiers caryotypes standards L’association entre anomalies chromosomiques et troubles de la reproduction → développement de laboratoires de cytogénétique animale principalement en Europe Depuis les années 90→ déclin de la cytogénétique animale clinique ATC le 10/09/2014

1971: identification de la Rob 1/29 en France Un peu d’histoire: 1968: établissement des premiers laboratoires de cytogénétique à l’INRA (Jouy en Josas : Paul Popescu et Toulouse : Roland Darré) 1971: identification de la Rob 1/29 en France 1986: décret rendant obligatoire l’analyse des taureaux avant leur utilisation en insémination artificielle 2009: obligation d’élever des sangliers présentant un caryotype à 36 chromosomes ATC le 10/09/2014 ATC le 10/09/2014

Aujourd’hui Comme chez l’Homme, peuvent être responsables d’anomalies congénitales, d’infertilité, de cancer…  Pertes économiques potentiellement importantes Quelques laboratoires principalement en Europe réalisent des contrôles systématiques (Ducos et al., 2008) Entre 8000 et 10000 analyses chromosomiques réalisées chaque année (principalement chez le porc et le bovin) Ces analyses concernent généralement des individus à phénotype normal Les individus anormaux sont éliminés par les éleveurs Les anomalies détectées sont généralement équilibrées

Résultats dans l’espèce bovine ATC le 10/09/2014

Rob 1/29 Résultats dans l’espèce bovine Obligation de tester les taureaux avant IA Baisse de la fertilité entre 3 and 5% (Gustavsson, 1969, 1971; Refsdal, 1976; Logue and Harvey, 1978; Dyren-dahl and Gustavsson, 1979; King et al., 1980, 1981; Popescu 1980; Schmutz et al., 1991; Wilson, 1991; Lonergan et al.,1994) 1700 analyses par an ATC le 10/09/2014

Freemartinisme Résultats dans l’espèce bovine Le freemartin est une femelle presque toujours stérile née d’une naissance gémellaire hétérosexuée. Cette anomalie apparait dans 90% des naissances comportant au moins un mâle et une femelle. Le diagnostic de freemartinisme est réalisé par la recherche de chimérisme leucocytaire XX/XY résultant de l’anastomose placentaire entre les jumeaux hétérosexués. ATC le 10/09/2014

Résultats dans l’espèce bovine Cattle Autres anomalies Rcp(8;9) Rcp(1;15) Rcp(7;7) mosaic 10.7% Inv (29) 2n=60,XY; 61,XXY (16%) Principales anomalies identifiées : ±20rcp, 7inv, 50Rob ±5 trisomies autosomales Aneuploïdies des chromosomes sexuels XXY, XY/XYY, XXX ATC le 10/09/2014

Résultats “sangliers” Environ 400 analyses par an ATC le 10/09/2014

Résultats “chevaux” Principales anomalies identifiées : ±10 rcp ±10 trisomies autosomales Aneuploidies des chromosomes sexuels X0, XXX, XXY, XX/XY, XX sex reversal, XY sex reversal Analyse de femelles présentant des problèmes de reproduction ATC le 10/09/2014

Résultats “chevaux” 63, X0 / 65, XYY dans un cas de pseudohermaphrodisme mâle Paget et al. (2001) ATC le 10/09/2014

Résultats “chiens” ATC le 10/09/2014

Cytogénétique dans l’espèce porcine ATC le 10/09/2014

Introduction: historique rapide Initiation du contrôle chromosomique à grande échelle dès 1995 1997 : J. Rech. Porcine, 29, 375-382 Présentation des objectifs, des premiers résultats 2002 : J. Rech. Porcine, 34, 269-275 Résultats 1998-2002 2007 : J. Rech. Porcine, 39, 281-288 Résultats 2002-2006 2012 : J. Rech. Porcine, 44, 43-44 Résultats 2007-2011 ATC le 10/09/2014

Anomalies chromosomiques: Introduction: motivations Anomalies chromosomiques: acquises (cancers …) constitutionnelles (malformations, problèmes de reproduction) Anomalies déséquilibrées (ex : trisomies) Anomalies équilibrées (structure) ATC le 10/09/2014

Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Introduction: motivations Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée ♂ et ♀ Production de gamètes déséquilibrés Baisse de la prolificité des conjointes de verrats porteurs 40% en moyenne (de -10% à -100%) pour les t. réciproques Conséquences économiques importantes ! ATC le 10/09/2014

Introduction: motivations ATC le 10/09/2014

Introduction: motivations Coût du contrôle Coût de l’absence de contrôle 1 verrat / 200 porteur d’anomalie Coût de la détection d’une anomalie : Coût direct : perte de porcelets (- 4 porcelets par portée) LW / LF P 90 doses / mois ( 110) 40 portées / mois 190 doses / mois ( 220) 80 portées / mois 200 x 60 € = 12 000 € Utilisation des verrats pendant 4 mois (le temps de constater l’hypoprolificité) 160 portées produites manque 640 porcelets ~ 20 000 € 320 portées produites manque 1280 porcelets ~ 40 000 € Coût indirect : diffusion de l’anomalie 50% des descendants d’un porteur d’anomalie sont eux-mêmes porteurs de l’anomalie ! La diffusion est potentiellement massive ! ATC le 10/09/2014

Organisation de la filière porcine Matériels et méthodes: Organisation de la filière porcine IFIP, 2008 Très large utilisation de l’ Insémination Artificielle (IA) Potentielle dissémination des anomalies chromosomiques Mise en place d’un contrôle chromosomique ATC le 10/09/2014

90% 3% 7% Matériels et méthodes: jeunes verrats de race pure (6-10 mois) 90% de ces animaux: 3 organismes de sélection 3% verrats hypoprolifiques 7% analyses familiales Cytogénétique classique (GTG) and FISH Leica GSL120 ATC le 10/09/2014

Résultats Plus de 31000 individus analysés à ce jour (1700/an) 169 anomalies de structure 29 anomalies des chromosomes sexuels ATC le 10/09/2014

0,47% Résultats Le plus important… La fréquence des anomalies de structure équilibrées: 0,47% Plus de 86% sont des translocations réciproques (baisse de prolificité de 40% en moyenne) ATC le 10/09/2014

Recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique Recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction ATC le 10/09/2014

Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Introduction: Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée ♂ et ♀ Production de gamètes déséquilibrés ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques 0,5% chez le porc ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Ségrégation alterne ATC le 10/09/2014

Facteurs influençant le comportement méiotique : Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Facteurs influençant le comportement méiotique : Chromosomes impliqués Taille des fragments transloqués… Fond génétique Sexe ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques rcp (12;14)(q13;q21) SSC12 SSC14 der14 der12 rcp (3;15)(q27;q13) SSC 3 SSC 15 der 15 der 3 ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Mâles : alternate/ adjacent 1 adjacent 2 3:1 diploïd/4:0 Femelles : adjacent-1 alternate/adjacent-1 adjacent-2 3:1 alternate ATC le 10/09/2014

Effet du sexe sur la ségrégation méiotique Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Effet du sexe sur la ségrégation méiotique ATC le 10/09/2014

Pas de variabilité inter- ou intra-individuelle Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Pas de variabilité inter- ou intra-individuelle ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques t(3;16)(q23;q22) and palatoschisis (fentes palatines) Ducos et al., 2004 Verrat transloqué Porcelet avec un caryotype déséquilibré 2n=38, XX (ou XY), der16 t(3;16)(q23;q22) ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes 0,013% chez le porc déséquilibrés équilibrés der(13;17) 13 17 Alterne Adjacente 3:0 ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes ATC le 10/09/2014

Inversion Paracentrique Production de gamètes déséquilibrés: inversions 0.03%-0,06% chez le porc Inversion Péricentrique Inversion Paracentrique ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: inversions SSC2 normal SSC2 inversé région inversée : 36 % p1.1 q2.1 région inversée : 23 % région inversée : 8 % q1.1 inv(2)(q1.3;q2.5) inv(2)(p1.1;q2.1) inv(2)(p1.1;q1.1) inv(1)(q1.2;q2.4) inv(1)(p2.1;q2.10) inv(1)(p2.4;q2.9) * SSC1 inversé SSC1 normal région inversée : 20 % région inversée : 71 % région inversée : 85,5 % ATC le 10/09/2014

Production de gamètes déséquilibrés: inversions ATC le 10/09/2014

Taux de gamètes recombinés <5% Production de gamètes déséquilibrés: inversions Taux de gamètes recombinés <5% ATC le 10/09/2014

Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Troubles de la spermatogenèse Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée ♂ et ♀ Production de gamètes déséquilibrés ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse Des anomalies du spermogramme sont observées dans 50% des couples infertiles (Huynch et al., 2002) La prevalence des anomalies chromosomiques est plus élevée chez les hommes presentant des spermogrammes anormaux (21X, azoospermies ; 7X oligospermies) (Mau-Holzmann, 2005) ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse Les remaniements peuvent conduire à des anomalies de la méiose responsables de troubles de la spermatogenèse (Van Assche 1996; Martin, 2008) 1) Association des chromosomes remaniés avec le bivalent XY:  propagation de l’inactivation du chromosome X aux segments autosomiques associés (Jaafar et al., 1993) transcription de gènes du chromosome X (Lifschytz and Lindsley, 1972) 2) Présence des protéines BRCA1, ATR and  H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012) ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse rcp(7p+;13q-) (Gustavsson et al., 1988) anomalies d’appariement des chromosomes en particulier dans les régions des points de cassure (Luciani and Guichaoua, 1990) (Oliver-Bonet et al., 2004) association des régions non appariées avec le bivalent sexuel apparié uniquement par les régions pseudo-autosomale ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse Présence des protéines BRCA1, ATR and  H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012) Turner et al. 2005 ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc RNA/DNA FISH ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : verrat 38,XY/39,XXY - cellules XXY dans le testicule mais seulement les cellules XY entrent en division de méiose -Méiose perturbée: spermatogenèse anormale environnement testiculaire inapproprié ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc Oligo-, Astheno-, Térato-spermique (19.106/ml) Spermatogenèse fortement perturbée ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc SCP1+SCP3 SCP3 γH2AX Centro Q + NO T + A SSC1 der14 der1 SSC14 Poster H. Barasc ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc SSC1: 293,925,712 der14 SSC1 der1 SSC1, BAC CH242- 298E5 SSC14: 148,080 der14 der1 SSC14 SSC14 , BAC SBAB-234D5 Poster H. Barasc ATC le 10/09/2014

Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc 2 3 4 der 1: PCR entre les primers 1 4 der 14: PCR entre les primers 3 2 ATC le 10/09/2014

UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique PERSPECTIVES ATC le 10/09/2014

Analyse des effets des anomalies Identification de remaniements chromosomiques et étude de leurs effets sur la reproduction Analyse de nouveaux cas identifiés lors du contrôle sur la plateforme donner un conseil plus documenté aux éleveurs ATC le 10/09/2014

Analyse de la recombinaison méiotique Analyse de la recombinaison et de l’interférence chez le porcs(N. Mary) Acquisition de données de référence, étude de l’effet de la race, de l’âge… A partir de ces données, analyser les effets des anomalies chromosomiques sur la recombinaison ATC le 10/09/2014

Analyse de la recombinaison méiotique Centromeres MLH1 SCP3

Analyse de l’infertilité mâle (génétique et épigénétique) Analyse CGH de verrats présentant des qualités de semence dégradées 1895 CNVs detectés plus de délétions que de duplications Corrélation nombre de délétions/concentration

Analyse des points de cassure Caractérisation des points de cassure séquençage verrats transloqués Analyse des intéractions des régions de points de cassure au cours de la méiose

Merci de votre attention UMR1388 INRA/INPT GenPhySE Plateforme de Cytogénétique Merci de votre attention http://www.envt.fr/node/327 http://www.envt.fr/node/541 ATC le 10/09/2014