LE SEQUENCAGE
OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP) - Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …) - Traitement à l’ExoSAP Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP) - Plasmide : Purification - Kit de purification - Quantification - Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille - Nanodrop
OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE REACTION DE SEQUENCE - Instructions du fournisseur - Quantité d’ADN - Volume du mélange réactionnel - Quantité d’amorce - Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x Volume total = 25 µl ADN (PCR) = 5 ng Amorce = 3 pmoles Tampon 5X = 2,5 µl Kit Big Dye = 1 µl H2O = qsp 25 µl Kit Big Dye contient : ADN Polymérase Tampon MgCl2 dNTP ddNTP*
OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur - Précipitation éthanolique NaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95% Lavage EtOH 70% - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)
- Purification sur billes magnétiques (Agencourt)
SEQUENCEUR CAPILLAIRE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ? A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante et en déduire la séquence protéique Trouver des homologies : Au niveau des gènes d’une même famille Au niveau d’un même gène dans différentes espèces Trouver des différences : Polymorphismes Mutations Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE
EXON 9 Homozygote A/A Hétérozygote A/G Homozygote G/G
Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié (onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité) 16 et 17/02/2005 : 190_1L
Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantes Même tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié 16 et 17/02/2005 : 190_1L
Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R
Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R
Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR : superposition des séquences sens et antisens.
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Faux-Sens Modifie l’acide aminé - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change Mutation Non Sens L’acide aminé est remplacé par un Stop - Stop prématuré production d’une protéine tronquée Mutation d’épissage - Au niveau du site donneur - Au niveau du site accepteur - Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture Mutation silencieuse Ne modifie pas l’acide aminé - Mutation intronique
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Faux-Sens ATA GTA (IleVal) c.1336A>G p.I446V
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Non Sens CGA TGA (Arg Stop) c.2587C>T p.R863X Production d’une protéine tronquée
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Délétion/Insertion Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT Séquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation d’épissage Intron 12 - c.1828+2T>G
SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE EXON INTRON %A 30 40 64 9 0 0 62 68 9 17 39 24 %T 20 7 13 12 0 100 6 12 5 63 22 26 %C 30 43 12 6 0 0 2 9 2 12 21 29 %G 19 9 12 73 100 0 29 12 84 9 18 20 A G G T A A G T
http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html
CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11
LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR - Mise en évidence de mutations A G Modification du site accepteur d’épissage
SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE INTRON EXON %A 15 10 10 15 6 15 11 19 12 3 10 25 4 100 0 22 17 %T 51 44 50 53 60 49 49 45 45 57 58 29 31 0 0 8 37 %C 19 25 31 21 24 30 33 28 36 36 28 22 65 0 0 18 22 %G 15 21 10 10 10 6 7 9 7 7 5 24 1 0 100 52 25 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y A G G Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base)
CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 GT AG AG AG AG Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 9 Exon 11
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation silencieuse Homozygote G/G Hétérozygote G/A Homozygote A/A Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation intronique Homozygote T/T Hétérozygote T/C Homozygote C/C Intron 2 – c.83-29G>A
LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Vérifier la présence de la mutation chez les parents du malade et d’autres membres de la famille - Mutation Faux-Sens - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change - Mutation Non Sens - Stop prématuré production d’une protéine tronquée - Vérification par Western Blot - Mutation d’épissage - Vérification par RT-PCR - Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture Mutation silencieuse ou intronique - Vérifier s’il s’agit d’un polymorphisme - Répertorié dans les banques de données - Tester 50 à 100 individus contrôle
Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 11 Exon 9 AG GT 250 N Ht Hm Exon 9 Exon 10 Exon 11 50 pb 150 pb 250 100 Exon 9 Exon 11 250 ??? Exon 9 Exon 10 Exon 11 250 ??? Exon 9 Exon 11
Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 AG GT 250 N Ht Hm Exon 9 Exon 10 Exon 11 50 pb 150 pb 50 pb 250 ??? Exon 9 Exon 10 Exon 11
ANALYSE DE MARQUEURS MICROSATELLITES LOGICIEL GENEMAPPER
Marqueur Microsatellite : Segment d’ADN contenant des répétitions en tandem de courts motifs de 2,3 ou 4 nucléotides. Très nombreux, dispersés sur tout le génome, ils sont le siège de variations à l’origine de polymorphismes multialléliques très informatifs
LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER Analyse de marqueurs microsatellites - PCR : une des amorces marquée par un fluorochrome (6FAM) - Produit de PCR fluorescent - Mélange du produit avec un marqueur de taille (35 à 350 pb) marqué par un autre fluorochrome - Séparation des fragments sur séquenceur capillaire - Détection des fragments fluorescents - Analyse des données
LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER Exemple : Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 11 chez un patient par FISH Déterminer les bornes de la délétion par analyse des marqueurs microsatellites de la région Choix de 5 marqueurs Réalisation des PCR sur l’ADN du patient et de ses parents Séparation des fragments sur séquenceur capillaire Analyse par GeneMapper C T D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP001791 AP001984 AP003305 AP002797 AC023118 AP002751 AP002370 AP000773 AP003026 AP000446 D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP000852 AP001825 AP000857 AP000639 AP003093 AP003095 AP002803
D11S4187
D11S1775
D11S873
D11S4135
D11S4147
LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER Exemple d’analyse de marqueurs microsatellites - Mise en évidence d’une microdélétion d’origine paternelle Cen D11S4187 D11S1775 D11S873 D11S4135 D11S4147 Tél 278 - 282 239 - 247 173 - 178 105 - 101 236 - 236 289 - 278 243 - 239 - 173 105 - 105 - 236 275 - 289 249 - 243 178 - 196 101 - 105 238 - 242 P M D
D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP001791 AP001984 AP003305 AP002797 AC023118 AP002751 AP002370 AP000773 AP003026 AP000446 D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP000852 AP001825 AP000857 AP000639 AP003093 AP003095 AP002803 C T Non Del Del Non Inf D11S1979 D11S 4135 est délété Tester D11S1795, D11S1354 et/ou D11S1979 pour déterminer la borne télomérique