Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. Jessica MICHEL Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle Groupement Hospitalier Est du CHU de Lyon Lyon le 10 Septembre 2014

La plateforme ACPA de Lyon Depuis 2007 Déficiences intellectuelles isolées/syndromiques et syndromes malformatifs Depuis 2011 Troubles du spectre autistique Depuis 2013 Syndromes polymalformatifs en prénatal Lyon le 10 Septembre 2014

La plateforme ACPA de Lyon Lyon le 10 Septembre 2014

Nécessité d’automatisation La plateforme ACPA de Lyon Nécessité d’automatisation Extraction ADN: Hamilton (en cours de validation) -> utilisation début 2015 Technique ACPA : BRAVO Agilent Interprétation résultats: - Agilent Cytogenomics - Cartagenia Lyon le 10 Septembre 2014

La plateforme ACPA de Lyon Dosage ADN : Nanodrop 1000® / Qubit® ACPA : - Four à hybridation - Scanner Agilent - Caisson ozone free Lyon le 10 Septembre 2014

Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform Préparation des ADN et pipetage Peut traiter 48 patients en simultané Améliorations attendues: Gain de temps. Reproductibilité de la technique. Qualité des résultats. Risque d’erreur réduit. Traçabilité. Description de l’appareillage. Lyon le 10 Septembre 2014

Appareillages spécifiques Douchette codes à barres Centrifugeuse compatible avec les plaques PCR 96 puits Thermocycleur Scelleuse Thermique ( + films thermosensibles) 2 « Racks » pour microtubes 1.5mL Lyon le 10 Septembre 2014

Consommables spécifiques Pour une série de 48 patients 1 plaque purification 5 Boites 96 pointes 250µL (Tips) « deep well  384 puits» réutilisable 1 seule fois 1 plaque « réservoir » 1 plaque « poubelle » Films protecteurs 3 Plaques PCR 96 puits Technique très « gourmande » en consommables

Avant passage sur le BRAVO Préparation d’une technique Avant passage sur le BRAVO Lyon le 10 Septembre 2014

Nous indiquons le nom, le prénom, notre n° SGL, concentration ADN Lyon le 10 Septembre 2014

Création automatique des plans de dépôt Lyon le 10 Septembre 2014

Création automatique du fichier pour le BRAVO Format csv Lyon le 10 Septembre 2014

Création automatique des étiquettes pour les tubes « finaux » (ADN marqués et combinés en « dye-swap ») Lyon le 10 Septembre 2014

Création automatique de l’attributefile pour Cytogenomics Lyon le 10 Septembre 2014

ACPA : Technique en « Dye-Swap » Image en miroir Patient A Patient B Patient D Patient C Cy5 Cy3 Quatuor del(13)(q33.1) et dup(13)(q33.1q34) Adaptation du protocole BRAVO. Lyon le 10 Septembre 2014

Application du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction) Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3) Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube Etape 6 : Dosage des fluorochromes Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner Etape 9 : Traitement informatique des données. Etapes automatisées par le BRAVO En jaune: Etapes réalisées « à façon » pour le laboratoire de Lyon Dilution des ADN : Normalise : Etape rajoutée pour Lyon.(2µg puis coupée en 2) Digestion : en 2 parties Marquage: chaque patient en 2 couleurs Purif: ok Combinaison: les patients sont combinés selon le plan de dépôt « dye-swap » Lyon le 10 Septembre 2014

Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction) Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3) Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube Etape 6 : Dosage des fluorochromes Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner Etape 9 : Traitement informatique des données. Etapes automatisées par le BRAVO Etapes manuelles En jaune: Etapes réalisées « à façon » pour le laboratoire de Lyon Dilution des ADN : Normalise : Etape rajoutée pour Lyon.(2µg puis coupée en 2) Digestion : en 2 parties Marquage: chaque patient en 2 couleurs Purif: ok Combinaison: les patients sont combinés selon le plan de dépôt « dye-swap » Lyon le 10 Septembre 2014

Validation : Premiers essais Essais sur 24 patients (soit 6 Quatuors): Test 1 : Vérifications d’anomalies connues Test 2 : Technique automatisée VS Technique manuelle Test 3: Patient commun à trois quatuors -> reproductibilité des résultats. Test 4: Self-Self. Test 5: ADN issus de 4 tissus de types différents. Problèmes initiaux rencontrés: Programmation : plan de dépôt Normalisation : volume d’eau prévu erroné -> rajout d’eau au cours de processus Mix marquage : protocole « CGH/SNP enzymatic » -> rajout de mix manuellement en cours de processus Re-tube : tout l’ADN marqué n’est pas récupéré à la fin de la technique (1/3) Lyon le 10 Septembre 2014

Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Manuel BRAVO Patient A (technique manuelle du 15.04.13) DLRS 0.13 / 0.15 del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mb de 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19) Patient A (BRAVO le 23.12.13) DLRS 0.20 / 0.20 Lyon le 10 Septembre 2014

Manuel BRAVO Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Manuel BRAVO Patient B (technique manuelle du 12.09.13) DLRS 0.12 / 0.12 del(17)(p13.3) de 1,5Mb de 51,885 à 1,564,729pb (hg19) dup(19)(q13.41p13.43) de 1,5Mb de 52,457,742 à 59,092,570pb (hg19) Patient B (BRAVO le 23.12.13) DLRS 0.28 / 0.20 Lyon le 10 Septembre 2014

Manuel BRAVO Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Manuel BRAVO Patient C (technique manuelle du 10.04.13) DLRS 0.16 / 0.16 del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19) Patient C (BRAVO le 23.12.13) DLRS 0.20 / 0.28 del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19) Lyon le 10 Septembre 2014

 Test 1: Toutes les CNV pathogènes ont été retrouvés à l’oligo prêt. Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Manuel BRAVO Patient D (technique manuelle du 06.08.13) DLRS 0.12 / 0.15 Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 58% Patient D (BRAVO le 23.12.13) DLRS 0.20 / 0.20 en mosaïque à 44%  Test 1: Toutes les CNV pathogènes ont été retrouvés à l’oligo prêt. Lyon le 10 Septembre 2014

Test 2 : (Quatuor 2) : Technique automatisée VS Technique Manuelle Qualité de la technique BRAVO dépendant des problèmes techniques rencontrés. Test 2 : Test à refaire  Manuel BRAVO Patient G : Technique Manuelle Patient G : BRAVO Lyon le 10 Septembre 2014

Test 3 : un patient (Quatuors 2 – 3 – 4) Patient E analysé 3 fois dans 3 quatuors différents (contre de nouveaux patients/témoins à chaque fois: patients F à N.) Technique réalisée le même jour, en même temps -> Lames hybridées à des dates ultérieurs différentes. Quatuor 1 DLRS 0.23/0.19 Quatuor 2 DLRS 0.26/0.20 Quatuor 3 DLRS 0.21/0.22 Test 3 : Test validé, les mêmes CNV sont retenus  Lyon le 10 Septembre 2014

Test 4: Self-self : Patient O Cy5 / Patient O Cy3  La « moving average » reste centrée sur le log²=0 DLRS : 0.20 Interval Based Report : 0 CNV Lyon le 10 Septembre 2014

Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congelé Patient S Sang (technique classique avec 2mL de sang) Patient T Liquide Amniotique (CBC : culture) Patient U Sang (quantité sang>2mL) Manuel Technique manuelle du 28.01.13 Patient R Cy5 / Témoin Tissu Cy3 DLRS 0.15 del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19) Technique BRAVO le 23.12.13 Patient R Cy5 / Patient UCy3 DLRS 0.22 Patient S Cy5 / Patient R Cy3 DLRS 0.18 del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19) BRAVO Lyon le 10 Septembre 2014

 Test 5 : Technique adaptable sur tissus spéciaux Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congelé Patient S Sang (technique classique avec 2mL de sang) Patient T Liquide Amniotique (CBC : Culture) Patient U Sang (quantité sang>2mL) Technique manuelle du 06.06.13 Patient T Cy5 / Témoin Cy3 DLRS 0.27 IBR 25 Lecture visuelle : 9 CNV retenus Manuel Technique BRAVO le 23.12.13 Patient T Cy5 / Patient S Cy3 DLRS 0.21 IBR 27 CNVs Patient U Cy5 / Patient T Cy3 DLRS 0.30 IBR 26 CNVs Lecture visuelle : 10 CNV retenus BRAVO Test 5 : Technique adaptable sur tissus spéciaux -> quantité d’ADN (Volume mini Bravo)  Lyon le 10 Septembre 2014

Premières séries de patients 1 Janvier-Février : 2 Séries de 24 patients Evènements et modifications du protocole Tests « à blanc » : heurt entre le bras de l’appareil et la « deep well 384 » -> 3 « têtes préleveuses » cassées à changer -> adaptation au consommable « deep well 384 » achetée (Marché HCL) Installation caisson -> décalage de la tête du Bravo Répartition mix de digestion : pas de mix dans 2 colonnes -> 2/6 Quatuors non marqués à refaire Intervention Agilent -> re-paramétrage des axes -> affiner le réglage de la hauteur Premières série : améliorations apportées -> Tester « à blanc » toutes les étapes -> 2 quatuors à refaire  Lyon le 10 Septembre 2014

Premières séries de patients 2 Mars : Séries de 24 patients Lectures (visuelles): Patient 1 : 12 CNVs Patient 2 : 16 CNVs Patient 3 : 16 CNVs Patient 4 : 11 CNVs Patient 5 : 11 CNVs Patient 6 : 11 CNVs Patient 7 : 12 CNVs Patient 8 : 14 CNVs Lyon le 10 Septembre 2014

Premières séries de patients 2 Mars : Séries de 24 patients Résultats corrects: 0,15<DLRS<0,20 environ 10 CNV/patient Mais problèmes rencontrés : apparitions de bulles -> problèmes de volumes  Intervention Agilent Troisième série : 6 quatuors validés  Lyon le 10 Septembre 2014

Validation de méthodes Série de 24 patients dont 12 patients avec anomalie connue Chaque Quatuor = 2 anciens patients + 2 nouveaux patients Toutes les anomalies connues ont été retrouvées. Validation technique du Bravo (sur 24 patients)  Lyon le 10 Septembre 2014

Suite séries de patients 3 Mars : Série de 48 patients Tests « à blanc » : Digestion – Marquage – Combinaison – Retube ( étapes ayant subi des changements) Normalisation erronée -> blocage à 23/48 patients. -> intérêt de tester « à blanc » toutes les étapes avec le véritable nombre de patients. Installation du nouveau protocole « normalisation ». Problème de format du fichier « feuille de route » -> caractères spéciaux. Plaque PCR défectueuse / Echec technique  Intervention Agilent 1 Série de 48 patients perdue. -> passage à 48 patients pas encore possible.  Lyon le 10 Septembre 2014

Depuis juillet : 2 séries de 48 sans problème : Passage en routine Suite séries de patients Mai – Juin – Juillet Problèmes à résoudre Programmation -> Bulles -> Répartition mix digestion : inégale -> rajout manuel -> Déplacement du bras Gestion des erreurs -> Problème position des « Tips »  Intervention Agilent Série de 48 patients validée suite à l’intervention d’Agilent  Depuis juillet : 2 séries de 48 sans problème : Passage en routine Lyon le 10 Septembre 2014

Evaluation du temps technique BRAVO (48 patients) Etapes Manuelle (8 patients) 1H Préparation (feuille de route, ADNs, …) 30 min 3H Normalisation (+ Split TipBox) 45 min Digestion 2H Marquage Purification 1H30 Combinaison et Re-tube 10 min Temps de préparation des différentes étapes et d’action du bravo (en dehors des temps d’incubation) ≈ 12 min / patient ≈ 25 min / patient Temps gagné  Lyon le 10 Septembre 2014

Avantages / Limites de la technique Vitesse -> tps technique/patient réduit Reproductibilité -> démarche qualité Qualité des résultats Réactivité du support technique Traçabilité (réactifs et patients) -> démarche qualité Préparation en amont -> 48 dossiers Tests « à blanc » obligatoires Applicable pour 4x180K pour l’instant Volume d’ADN mini (+5µL) et microtubes compatibles avec « Racks » -> aliquots reçus extraits/échantillons précieux Formation logiciel et problèmes informatiques Consommables (quantité, colonnes de purifications non utilisées) Lyon le 10 Septembre 2014

Conclusions et perspectives Réorganisation du service -> 1 technicien/Bravo -> hybridations « en série » par autres techniciens. Tests « à blanc » sur toutes les étapes et pour chaque programme (nombre patients – formats lames)-> après chaque modification -> temps + consommables Perspectives : Automatisation plus globale du processus « ACPA »: Extraction ADN Passage à Cytogenomics -> possibilité d’autoprocessing Refaire quelques tests-> « Validation des méthodes » -> Accréditation ACPA en acquis : ADN patients / ADN Témoin -> reprogrammation  Intervention Agilent Lyon le 10 Septembre 2014

Remerciements ACPA Laboratoire Réseau AChroPuce Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. ACPA Damien Sanlaville Marianne Till Audrey Labalme Nicolas Chatron Caroline Schluth Eudeline Alix Chantal Beche Christelle Angei Laurence Caine Hélène Guilbert Isabelle Morin Clément Bonnefille Cassandra Nivou Jessica Michel Laboratoire Caroline Perbet Emmanuelle Banquart Christine Bel Anne Fautrelle Catherine Hempel Brigitte Jelassi Sylvie Josué Chantal Lavert Michelle Martin Christine Valex Corinne Buis Azim Rafat Patrick Edery Réseau AChroPuce Support Agilent Lyon le 10 Septembre 2014

Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 En manuel Avec Bravo Cyanine 5 Concentration ADNCy5 Quantité fluorochrome Cyanine 5 / Cyanine 3 Concentration ADNCy5 / Cy3 Quantité fluorochromes combinés Cyanine 3 Concentration ADNCy3 Quantité fluorochrome Dilution car volume 2X plus grand. Bruit de fond Cy3 dans Cy5. Lyon le 10 Septembre 2014

Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 En manuel

Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 En manuel

Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 Avec Bravo

Modifications supplémentaires demandées Conséquences Digestion – Marquage : Possibilité d’introduire un « STOP » entre la digestion et le marquage Répartir la technique sur plusieurs jours Digestion : Suppression de l’étape de transfert de la plaque « ADN normalisés » vers une 2nde plaque « digestion » Gain de temps Gain de quantité d’ADN Economie de consommables Re-tube : Récupérer tout l’ADN marqué/combiné Gain de quantité d’ADN marqué Etape de concentration « speedvacc » supplémentaire   Lyon le 10 Septembre 2014