1/ Accroitre une population existante de lapins de garenne. A.G. Bio-Espace 2009 Objectif : 1/ Accroitre une population existante de lapins de garenne. 2/ Créer une population de lapins sur un territoire qui en est dépourvu.

Vacciner les lapins contre la myxo et la VHD sans avoir à les capturer Myxomatose et VHD, provoquent 88% de mortalité chez les adultes et 99% chez les juvéniles. Marchandeau et al, Office National de la Chasse. J. Wildlife Diseases  1998  34(3),  429-35 Notre approche : Vacciner les lapins contre la myxo et la VHD sans avoir à les capturer

Myxomatose Revenons sur quelques diapositives de l’AG 2008.

4-6 Mars 2008 le Dr Brian Cooke visite le laboratoire de Bio-Espace

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke Il visite un terrain sur lequel des puces/BE4, sont lâchées.

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke Le plateau du Larzac

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke Le Dr Cook est. étonné de ce qu’il voit.

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke Conclusion du Dr Cooke : Votre élevage de puces est remarquable. Vous produisez plus de 4 millions de puces/an avec 8 lapins. A l’origine de l’introduction des puces en Australie nous en avons produit 1 million, et ce ne fut pas très facile même avec beaucoup plus de lapins. Ici sur le Larzac je considère qu’il y a entre 10 et 15 lapins / ha. L’efficacité des puces-BE4 sur le terrain est donc évidente.

Rappelons pourquoi l’efficacité du couple « puces-BE4 » est évidente sur le terrain.

Vaccination contre la myxomatose Paramètre n° 1 Le virus

Dans la nature ces virus ne sont pas également répartis. Les virus de la myxo Dans la nature, le virus de la myxomatose a spontanément évolué de la virulence I à la virulence V (FENNER 1957) ATTENTION le taux de mortalité donné dans ce tableau est mesuré sur des populations de lapins domestiques n’ayant jamais rencontré la myxomatose Dans la nature ces virus ne sont pas également répartis.

Dans la nature ces virus ne sont pas également répartis. Un équilibre s’établit entre les virus de virulence I, II, III, IV, et V (FENNER et ROSS ,1994).

Répartition des virus I et II Pour les virus de virulence I et II - Les lapins meurent vite (transmission courte)‏ Même s’ils sont bien transmis par les insectes, Au total ces virus sont peu présents.

Répartition des virus III et IV pour les virus de virulence III et IV - le temps de survie des lapins est plus long - La transmission par les insectes est bonne, Au total: ils sont très présents.

Répartition du virus V pour le virus de virulence V - le temps de survie des lapins est très long jusqu’à la guérison - Mais la transmission par les insectes est très mauvaise, Au total: ils sont très peu présents.

Paramètre n° 2 Résistance des lapins à la myxomatose Ce paramètre n’est que rarement pris en considération. Il est pourtant bien réel et documenté. FENNER 1983-1994

Apparition de la résistance Evolution de la résistance d'une population de lapins sauvages après 7 épizooties de myxomatose (7 ans). Après chaque épizooties, les jeunes lapins (séronégatifs) sont soumis à un virus d'épreuve de virulence III. (FENNER 1983 et 1994) 30 16 54 7 11 14 75 53 5 12 26 61 50 4 2 93 80 3 95 88 90 légers moyens Sévères Signes cliniques des lapins éprouvés Taux de mortalité en % Nombre d’épizooties auxquelles la population a été exposée. (une/an)‏ Il est ainsi clair qu’une population de lapins soumise à une myxomatose annuelle a un faible taux de mortalité avec des signes cliniques faibles. Au-delà de 6, 7 ans il n’y a plus d’évolution. (la résistance n’augmente plus.)‏

La résistance est fonction de la force des virus. Lorsqu’une population de lapins est soumise à une pression annuelle de la myxomatose de virulence I, II, III, IV, la résistance de cette population augmente jusqu’à un maximum atteint en 6, 7 ans. FENNER (1983 et 1994). Noter que les virus trop atténués ne donnent pas de résistance aux lapins. Mais attention en l'absence de pression myxomateuse cette "résistance" acquise en 6, 7 ans, se perd en 3 ans. (SOBEY- Communication personnelle, et Bio-Espace)

La résistance En résumé

Fonctionnement de la myxomatose Cinq paramètres sont en interaction dans le fonctionnement de la myxomatose (SEYMOUR, 1992) : 1 - la densité des lapins, 2 - les ressources alimentaires, 3 - les vecteurs et leur nombre (puces, moustiques...) 4 - la virulence des virus, 5 - et la résistance des lapins.

BIO–ESPACE la résistance des lapins est le paramètre clé du déclenchement et du développement de la myxomatose (SEYMOUR, 1992)

BIO–ESPACE - Si la résistance est très forte, la maladie ne se déclenche pas (SEYMOUR, 1992) - Si, la résistance est très faible, la maladie se déclenche toujours (SEYMOUR, 1992)

Créer et maintenir la résistance Si les chasseurs veulent accroître une population de lapins sauvages il faut à tout prix qu’ils conservent la résistance à la myxomatose, et si cette résistance n’existe pas il faut qu’ils la créent. La solution, est d’utiliser le virus de virulence IV, et de le délivrer par les puces. Avec le Virus de virulence IV, si les lapins ont une bonne résistance, et si ce virus est délivré par les puces, on vaccine sans mortalité, et on maintient la résistance.

Résistance-Résistance-Résistance Pouvoir pathogène de la souche BE4 sur lapins domestiques et sauvages. 0 mort 100 % survie symptômes quasi invisibles injection de BE4 par les puces (doses très faibles)‏ 57 lapins sauvages séronégatifs, en provenance de territoires sur lesquels les épizooties de myxomatose sont régulières. Sur lapins sauvages 5 morts. 89 % survie symptômes très faibles injection de BE4 (100 DI 50)‏ 47 lapins sauvages séronégatifs, en provenance de territoires sur lesquels les épizooties de myxomatose sont régulières. 18 morts. 40% survie. Symptômes moyens à forts 30 jeunes lapins séronégatifs, issus d’animaux (vaccinés pendant 7 ans au SG33) Sur lapins domestiques 1/ Évidence du rôle de la résistance, 2/ Rôle très positif de la transmission par les puces.

4-6 Mars 2008 Visite du Dr Brian Cooke Voilà donc les raisons pour lesquelles le Dr Cook est. étonné de ce qu’il voit.

Ça marche Il suffit d’appliquer. Conclusion coté myxo Ça marche Il suffit d’appliquer.

Vaccination contre la VHD Deux programmes Recombinants Myxo/VHD. Virus VHD naturellement atténué.

Recombinant Myxo/VHD Il ne faut pas vouloir protéger une population contre la VHD, et la laisser mourir de la myxomatose. En conséquence il faut que dans le recombinant myxo/VHD, la partie myxo soit aussi virulente que le BE4 seul. La diapo suivante montre la réaction obtenue par injection de BE4 sur des lapins domestiques 10-11 J après l’injection. C’est cette réaction qu’il faudrait avoir avec un recombinant Myxo-VHD

Exemple de réaction au BE4 sur des lapins domestiques 10 et11jours après l’injection.

Résultats antérieurs autres que ceux de BioEspace 1/ Quant on recombine un virus la virulence du porteur décroit. (toujours)‏ 2/ Si on part d’un porteur myxo moins virulent que force IV, le recombinant sera forcément encore moins virulent et la résistance ne sera pas au rendez vous. 3/ Toutes les constructions précédentes sont délibérément utilisé (pour des raisons réglementaires) un porteur moins virulent que force IV (soit le SG33, soit un virus de force V) donc les recombinants obtenus ne sont pas assez virulents.

Les deux virus qui doivent être recombinés. Virus de la Myxomatose 2OO nm ADN double brin 161 773 Paires de bases Virus de la VHD40 nm ARN simple brin 7437 bases Structure RX Gènome Myxo (161 773 pb)‏ Gènome VHD (7437 b)‏ gène TK (non essentiel) 500 pb Gène VP60 (2074 b)‏

Première approche de recombinant virulent La première approche (Yi-Montpellier) a consisté à introduire le gène de la VP60, au centre du gène TK. Pour pouvoir isoler le recombinant du milieu de culture il a introduit un gène supplémentaire (lacZ de 4000 pb) qui code pour une protéine  gal laquelle colore en bleu les cellules dans lesquelles le recombinant se multiplie. Ci-dessous: le génomes naturel du virus myxo et du virus recombiné (zoom dans région TK), gène TK (non essentiel) 500 pb génome du virus de la myxomatose TK Génome BE4 « recombinant  TK/2 gène VP60(2,1kb)‏ + Gène Lac Z (4000pb)‏ TK/2 LacZ introduit pour pouvoir isoler le recombinant via  gal

Plage de multiplication du virus myxomateux BE4 sur cellules RK13 Plages de multiplication du virus recombinant BE4-VP60-LacZ, dans lesquelles on voit (au microscope) des plages colorées en bleues par la  gal. Ce bleu indique que des virus recombinants Ce sont multipliés dans ces cellules. La sélection de ces plages bleu est longue et la purification fastidieuse

résultats Le recombinant obtenu (BE4-TK1/2-VP60-LacZ-TK1/2) inoculé à des lapins provoque le développement d’anticorps contre la myxo et la VHD. Génome BE4 « recombinant  TK/2 VP60=2100pb + LacZ = 4000pb TK/2 Mais les taux d’anticorps sont faibles, et les symptômes très légers. Rien à voir avec les symptômes provoqués par le BE4 seul. Conclusion ce recombinant n’est pas assez virulent. Hypothèse : le gène du LacZ (4000 pb) perturbe trop le génome du virus myxo porteur.

Recherche d’un deuxième recombinant. Objectif supprimer le LacZ : BE4-TK1/2-VP60-TK1/2. Yi Li et al ont construit les outils pour obtenir ce recombinant. (noter qu’il ne devait plus exprimer la -gal pour le reconnaitre)‏ Génome BE4 « recombinant  TK/2 VP60=2100pb TK/2 Yi Li et al ont construit des cellules RK13 spéciales (RK13-TK- ) pour cultiver ce nouveau recombinant. (voir AG Bio Espace 2008)‏ Mais à l’arrivée « ce nouveau recombinant » n’a pas voulu pousser sur ces cellules. (Donc échec, au moins temporaire. Le Pr LI cherche à comprendre pourquoi ça ne pousse pas)

Recherche d’un troisième recombinant Remplacer le LacZ par le gène GFP (Green Fluorescent Proteine) bien plus court (1000 pb) : le recombinant visé est le BE4-TK1/2-VP60-GFP-TK1/2. Génome BE4 « recombinant  TK/2 VP60=2100pb GFP1000pb TK/2 Le Pr Li et al construisent ce recombinant. (au lieu d’exprimer la -gal bleu, il exprimera la « green fluorescent protein »)‏ Ce recombinant devraient pouvoir être cultivé dans des cellules RK13 normales. A l’arrivée « ce nouveau recombinant » qui devrait être obtenu dans les mois qui viennent pourrait être plus virulent que celui obtenu avec la  gal.

Recherche d’un quatrième recombinant Utiliser un gène non essentiel autre que le TK. le Pr Li a identifié ce second gène non essentiel pour le virus de la myxo. Génome BE4 « recombinant  NE/2 VP60=2100pb GFP1000pb NE/2 A partir de cet autre gène (non essentiel, (NE) il pourra construire un autre recombinants BE4-NE1/2-VP60-GFP-NE1/2. Cette construction sera entreprise si les recombinants précédents n’ont pas la virulence nécessaire. N’oublions pas que la recombinaison fait le plus souvent baisser la virulence. Autre piste de travail : Le Pr Li tentera dans un proche futur de créer des recombinants à partir du virus de virulence III. On n’a donc pas encore le succès espéré, mais Il reste beaucoup de pistes à explorer.

Sur le programme recombinant Myxo/VHD Le Pr LI pense qu’il aura des produits à tester Avant la fin de l’année 2009.

VHD Projet Virus naturellement atténué. En parallèle à la stratégie vaccin recombinant, Je propose d’analyser la possibilité de vacciner contre la VHD, en utilisant un virus naturellement atténué. Il existe en effet deux publications intéressantes dans ce domaine

Rappelons Qu’il à, pour l’instant, été impossible de cultiver le virus de la RHDV. Il ne se multiplie que dans certains organes du lapin. Mais lors de ces multiplications il s’atténue, c’est à dire devient non pathogène et provoque la formation d’anticorps contre le virus pathogène (il devient donc un vaccin naturel). L’idée est de savoir si on peut utiliser ces propriétés pour vacciner les populations de lapins qui nous intéresse.

RHDV non pathogène Le premier virus RHDV non pathogène a été détecté dans un élevage industriel. Dans cet élevage il a été montré que ce virus non pathogène se propage de lapin à lapin, et protège tout l’élevage. Ce virus à été caractérisé. La question était de savoir si un tel virus était présent dans un milieu naturel, et s’il s’y propageait naturellement.

La réponse à cette question est positive. Voir la publication ci-dessous. Ile de Lambay 250 ha au large des cotes d’Irlande

Ma proposition 1/ Sélectionner les secteurs à lapins si possibles traités au Puces/BE4 depuis plusieurs années. 2/ Collecter des échantillons.(on vous dira lesquels) 3/ Le Pr. Yi Li analysera les Anticorps myxo / VHD. 4/ Si des anticorps contre la VHD sont présents, le Pr Li recherchera le virus et le positionnera sur l’arbre phylogénétique pour connaître son origine. Ce sera important pour la suite.

Ma proposition Dans l’étape suivante, 5/ On pourrait envisager de transporter des lapins d’un site naturellement protégé par un virus de la VHD (non pathogène) vers un site non protégé. 6/ Par des analyses ultérieures, on pourrait vérifier si les virus de la VHD non pathogènes ont bien été transmis du premier site vers le second.(d’où la nécessité de connaitre l’origine des virus) 7/ si on pouvait mettre en évidence une telle méthode de protection ce serait super, et incontournable. Sans bien sur abandonner la piste recombinante.

Question ? Souhaitez vous que cette possibilité de protection contre la VHD soit étudiée ? Si Oui, IL FAUT ORGANISER CE PROJET. Lors de l’AG de l’Aveyron j’ai rencontré un chasseur qui accepterait de s’occuper de cette organisation. (collecte des échantillons, retour des informations de Chine, diffusion des résultats, suivie ....) Pierre -André Collot impasse des quatre vents 12490 Montjaux tél 05 65 46 54 10 port 0619437331 fax 0975718626

L’équipe travaillant en Chine sur le projet recombinant (un Professeur un ingénieur et 3 étudiants)

Merci de votre attention