Expression, purification, et analyse structurale des protéines membranaires Cours L3 Mars 2009 Isabelle Mus-Veteau, Chargée de Recherches CNRS Laboratoire de Biologie et Physiopathologies des Systèmes Intégrés Bat de recherches Sciences Naturelles, 4eme niveau Faculté des Sciences de Nice

Expression, purification et analyse structurale des protéines membranaires Plan des 4 heures de cours: Qu’est ce qu ’une protéines membranaire? Localisation Fonctions Propriétés intrinsèques Conséquences sur l’étude structurale de ces protéines Expression hétérologue des protéines membranaires Purification des protéines membranaires Préparation des extraits membranaires Solubilisation des protéines membranaires Chromatographies Stabilité des protéines membranaires en solution et cristallisation Quelques exemples de structures de protéines membranaires mammifères recombinantes exprimées en système hétérologue

Qu’est ce qu’une protéine membranaire ? 1. Localisation et fonctions Situées à la membrane des cellules 20 - 30 % des génomes séquencés codent pour des protéines membranaires Impliquées dans: Le transport des ions (canaux ioniques) Le transport des solutés (nutriments, sucres, métaux, lipides, …) Le transport de l’eau (aquaporines) Pores (porines, …) La transmission des signaux entre le milieu extérieur et la cellules (récepteurs hormonaux, récepteurs couplés aux protéines G et autres): prolifération, réparation cellulaire, ... Reconnaissance intercellulaire Cibles de 50% des médicaments actuellement sur le marché

Qu’est ce qu’une protéine membranaire ? 2. Propriétés intrinsèques des Protéines membranaires Entourées de lipides : environnement hydrophobe les parties intégrées dans la membrane sont majoritairement constituées d’acides aminés hydrophobes (n'absorbent pas l'eau) : Alanine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, tryptophane, tyrosine, valine organisés soit en hélice a, soit en feuillet b.

L’hélice a Enroulement régulier d'une chaîne polypeptidique sur elle-même. Les atomes d'azote et d'oxygène du squelette protéique sont reliés entre eux par des liaisons hydrogènes parallèles à l'axe de l'hélice: l'acide aminé n est relié à l'acide aminé n + 4. Un tour d'hélice correspond à 3,6 acides aminés ou résidus. Les hélices comprennent au minimum 5 résidus et au maximum 40 résidus. Certains acides aminés exercent une influence sur la stabilité de la structure hélicoïdale. La leucine, le tryptophane et la phénylalanine stabilisent l'hélice. En revanche, la valine, l'isoleucine, la tyrosine et des résidus diacides et dibasiques voisins la déstabilisent. La présence de proline dans une chaîne polypeptidique entraîne souvent l'interruption de la structure en hélice alpha.

Les feuillets b ou Feuillets b plissé plis successifs avec différents ondulements de la chaîne polypeptidique (comme un accordéon). structure plus lâche et plus plane que l'hélice a : distance entre les groupements CO et NH qui forment des liaisons hydrogènes (liaison faible, non covalente) est de 0,70 nm (plus que dans les hélice a, donc plus lâche). Il existe 2 types de disposition de feuillets b : feuillets b antiparallèles et feuillets b parallèles. Les chaines polypeptidiques peuvent soit former uniquement des hélices a (Transporteurs, canaux ioniques, récepteurs couplés aux protéines G), soit uniquement des feuillets b plissé (porines), mais on peut aussi avoir une association de ces deux types d'organisations. La pathogénicité du prion (protéine responsable de la maladie de Creutzfeldt-Jakob) est due à la transformation d'une hélice a en feuillet b.

Qu’est ce qu’une protéine membranaire ? 3. Conséquences de ces propriétés : La majorité des protéines membranaires sont présentent naturellement en très faible quantité la purification et l’analyse structurale de ces protéines nécessitent la mise au point de leur production en système d’expression hétérologue Protéines non solubles en milieu aqueux la purification et l’analyse structurale de ces protéines nécessitent l’utilisation de détergents pour extraire ces protéines de la membrane et les conserver en solution Très peu de structures de protéines membranaires: 250 structures de PM pour 42 000 structures de protéines solubles dans la Protein Data Bank Sur ces 250 structures de PM, une trentaine sont issues de PM eucaryotes.

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires Doit permettre la production de la protéine d’intérêt en quantité suffisante pour la purification et l’analyse structurale, et dans une conformation native et fonctionnelle 2. 1. La bactérie Escherichia coli Avantages Inconvénients Facile à cultiver en grosse quantité Pas de modification post-traductionnelle Croissance rapide Surexpression toxique pour la bactérie Peu coûteux Agrégation dans des corps d’inclusion

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 1. La bactérie 2 .1. 1. Utilisation des corps d’inclusion formés dans E. coli. Purification des PM dans des conditions dénaturantes Renaturation des PM purifiées dans un détergent non dénaturant Faible % de protéines renaturées Problèmes de séparation des protéines dénaturées et renaturées 2. 1. 2. Solutions pour favoriser l’expression des PM étrangères à la membrane de la Bactérie E. coli Développement de souches de bactéries mutantes résistantes Utilisation de vecteurs d’expression avec des promoteurs moins forts Co-expression de la protéine d’intérêt avec la sous-unité b de l’ATP synthase qui entraîne une prolifération des membranes intracellulaires 2. 1. 3. Utilisation de la bactérie gram positive Lactococcus lactis Ne produit pas d’endotoxines donc plus résistante à la présence de PM étrangères Ne fait pas de corps d’inclusion Possède une seule membrane Activité protéasique plus faible que E. coli Production de PM eucaryotes dans L. lactis en cours d’étude

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 2. La levure Avantages Inconvénients Facile à cultiver en grosse quantité Peu coûteux Croissance rapide : une génération toutes les 2 ou 3 heures en fonction des conditions de culture Pas de cholestérol dans les membranes Organisme unicellulaire eucaryote : réalise les modification post-traductionnelles Hyperglycosylation et sucres différents des cellules mammifères

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 2. La levure 2 .2. 1. Utilisation de la levure Saccharomyces cerevisiae Outil génétique disponible (nombreux mutants: déficients en protéases, …) Surexpression modérée = adressage à la membrane Conditions de culture et de production bien étudiées (meilleure production à basse température, effet positif de certains additifs comme le DMSO, le glycérol, ….) Nombreuses PM produites dans S. cerevisiae La 1ere structure de PM mammifère recombinante a été produite dans S. cerevisiae (ATPase calcium du rétuculum de lapin) 2. 2. 2. Utilisation de la levure Pichia pastoris Mêmes propriétés que S. cerevisiae mais pousse à très haute densité cellulaire Nombreux mutants disponibles comme des mutants déficients en protéases Sur 11 structures de PM mammifères recombinantes: 3 ont été produites dans P. pastoris

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 3. Les cellules d’insecte Avantages Inconvénients Poussent à haute densité cellulaire Croissance plus lente que les levures Culture en suspension Coût plus élevé que les bactéries ou les levures Modifications post-traductionnelles proches de celles des cellules de mammifères Faible glycosylation Ergostérol à la place du cholestérol dans les membrane

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 3. Les cellules d’insecte 2. 3. 1. Expression de PM recombinantes par infection des cellules d’insectes par baculovirus Cellules utilisées: cellules de papillons Spodoptera frugiperda (Sf9 et Sf21) ou Trichoplusia ni (Hi5) Fort taux d’expression des protéines recombinantes grâce au promoteur de la polyédrine (protéine très fortement exprimée par la baculovirus Système qui a permis la production des récepteurs adrénergiques b1 et b2 recombinants à partir desquels les structures 3D ont été obtenues. Exploitation industrielle 2. 3. 2. Expression de PM recombinantes par transfection stable de cellules de Drosophile Schneider2 Cellules immortalisées non-tumorigéniques isolées de cultures primaires de cellules d’embryons de Drosophila melanogaster Cellules qui poussent à très haute densité cellulaire 3.107 cellules par mL

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 4. Les cellules de mammifères Avantages Inconvénients Composition lipidique de la membrane: présence de cholestérol Croissance plus lente Modifications post-traductionnelles correctes Coût très élevé Cultures en grosse quantité difficiles mais l’adaptation des cellules à pousser en suspension permet de faciliter la production.

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 4. Les cellules de mammifères 2. 4. 1. Cellules de mammifères infectées par le virus de la forêt de Semliki (SFV) Le SFV a été initialement isolé à partir de moustiques en Ouganda en 1944. Il est essentiellement localisé en Afrique sub-saharienne. Le SFV est un alphavirus (famille des Togaviridae), petit virus enveloppé (70 nm) à génome ARN simple brin de polarité positive de 11,7 kilobases, pouvant se répliquer dans toutes les cellules animales. Lors de l'infection cellulaire, l'enveloppe virale, par l'intermédiaire des protéines de spicule situées à sa surface, permet l'entrée du virion dans la cellule cible. Le gène étranger est cloné dans le vecteur d'expression et les plasmides obtenus peuvent être utilisés pour la production in vitro de transcrits SFV qui initieront la réplication lors de leur introduction dans des cellules animales. 2. 4. 2. Cellules de mammifères transfectées Utilisation de la méthode de Large Scale Transient transfection (LSTT): transfection sur un volume important de cellules poussant en suspension. A permis la production du premier RCPG recombinant à partir duquel une structure 3D a pu être résolue: la rhodopsine.

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 5. Expression in vitro Avantages Inconvénients Composition entièrement contrôlée Coût très élevé Pas de dégradation par les protéases Pas de modification post-traductionnelle Niveaux de production très élevés sans toxicité

2. Systèmes d’expression hétérologue des protéines membranaires 2. 5. Expression in vitro Ce système mime l’environnement cytoplasmique de la cellule. Réacteur dans lequel on place un lysat bactérien et tout additif nécessaire à l’expression fonctionnelle et la stabilité de la protéine à synthétiser: inhibiteurs de protéases co-facteurs substrats liposomes ou détergents