IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie Hôpital A. Mami de l’Ariana 31-Mars-2006

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEXE Mycobacterium tuberculosis: réservoir homme Mycobacterium bovis: réservoir bovin Mycobacterium africanum: Afrique noir MYCOBACTERIES NON TUBERCULEUSES ATYPIQUES Présentes dans l’environnement sans danger pour l’homme Responsable d’infections opportunistes chez les ID Pays développés: recrudescence de la tuberculose (SIDA) Nécessité d’identification des mycobactéries MYCOBACTERIUM LEPRAE

CLASSIFICATION DE RUNYON GROUPE O : Les bacilles tuberculeux GROUPE I : Mycobactéries à croissance lente, photochromogènes GROUPE II : Mycobactéries à croissance lente, scotochromogènes GROUPE III : Mycobactéries à croissance lente, non chromogènes GROUPE IV : Mycobactéries à croissance rapide, pigmentées ou non

Apparition des colonies ASPECT MACROSCOPIQUE M.tuberculosis M. africanum M.bovis M.bovis BCG Apparition des colonies 15-20j 60-90j 20-40j Aspect des colonies Eugoniques Rugueuses Chou fleur Beige Dysgoniques Plates Mate Lisses Hémisphériques Blanche

PRODUCTION DE PIGMENT TECHNIQUE : Ensemencer deux tubes L et O avec une dilution 10-5, culture à 37°. Croissance sur tube L, illuminer tube O sous une lampe à fluoréscence RESULTATS : Mycobactéries sans pigmentation: Souche non chromogène ( gp III) Mycobactéries pigmentant sans illumination: Souche scotochromogène (gp II) Mycobactéries pigmentant à la lumière: Souche photochromogène (gp I)

CULTURE DES MYCOBACTERIES

ASPECT MICROSCOPIQUE M. tuberculosis: bien colorés, petits, incurvés M. kansasii: plus longs, aspect saucissoné,en échelle

IDENTIFICATION PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES Indispensables Seuls à établir un diagnostic d’espèces Applicables sur les colonies obtenues par culture Mycobactéries tuberculosis complexe ≠ Atypiques

NIACINE TEST Principe: Recherche de la niacine ou acide nicotinique Technique: R1: aniline à 4% dans alcool éthylique à 95° (fl brun à 4°) R2 :bromure de cyanogène à 10% dans ED (fl brun à 4°) Mode opératoire: +1ml ED dans un tube de culture, laisser en contact 15min, reprendre 0.5ml dans un tube et ajouter 0.5ml R1 +0.5ml R2: col jaune Résultats: M. tuberculosis: niacine + M. africanum: production variable M. bovis: Négatif Mycobactéries non tuberculeues: Négatif NB: Tests sur bandelettes (DIFCO) remplace cette manipulation

NIACINE TEST

NIACINE TEST SUR BANDELETTES

REDUCTION DES NITRATES Techniques: R1: Sol de nitrate de Na 0.01M R2 : Hcl dilué R3 : sol de sulfaniline R4 : sol de alpha naphtylamine Mode opératoire: Mettre en suspension des colonies dans la solution1, incuber 2 heures à 37°, ajouter une goutte R2, deux gouttes R3 et deux gouttes R4 Résultats: Positif, virage de la coloration au rouge (intensité de la couleur: + jusqu’à 5+) M.tuberculosis: positif M.bovis et M. africanum: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif NB: Pour confirmer une réaction négative ajouter poudre de zinc

TEST DE NITRATE

THERMOSENSIBILITE DE LA CATALASE TECHNIQUE: Deux tubes contenant une suspension bactérienne dans tampon phosphate, un tube à température ambiante, l’autre à 68°c pendant 20 min. Après refroidissement ajouter 0.5ml de H2O2 à 30% RESULTAT: Positif, observation de bulles à la surface La catalase est thermolabile pour les 3 espèces pathogènes, thermorésistante pour les atypiques

RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune BETA- GLUCOSIDASE TECHNIQUE: Suspension de colonies de culture dans 0.5ml de sol. de para nitrophényl ß-D glucoside, 3h à 37° RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune M.tuberculosis: positif M. bovis: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif (groupe I variable)

UREASE EN MILIEU UREE-INDOLE M. tuberculosis: positif M UREASE EN MILIEU UREE-INDOLE M.tuberculosis: positif M.africanum: variable M. bovis: négatif ARYLSULFATASE Subtsrat: Disulfate de phénolphtaleine tripotassique dans ED Milieu: Dubos Réactif: Carbonate de sodium Technique: suspension de colonies de culture dans un tube contenant le substrat plus le milieu de Dubos, incuber 3 j à 37° et ajouter quelques gouttes de Na2CO3 Résultat: positif, coloration rouge (comparer à un tube étalon) Mycobactéries tuberculeuses: négatif Mycobactéries atypiques du groupe IV (complexe fortiutum et chelonae): Positif

UTILISATION DU MILIEU LÖWENSTEIN-JENSEN CONTENANT DIFFERENTS INHIBITEURS TECHNIQUE: Ensemencer avec 0.1ml de la dilution au 1/1000 de la suspension bactérienne, incuber 3 semaines à 37° P. nitrobenzoate PNB à 500ug/ml: Sensible pour les M.de la tuberculose: Hydroxylamine HYD à 250 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose Acide thiophène 2 carboxylique (TCH) à 2 ug/ml: Résultats: M. tuberculosis: Résistant M. bovis: Sensible M. non tuberculeuse: Résistant D-cyclosérine: Résistant avec BCG Pyrazinamide PZA à 50 et 100ug/ml: Résistant avec bovis

IDENTIFICATION DES PRINCIPALES MYCOBACTERIES Groupe de de Runyon Mycobactérium spp Pigm ObLm T Temps N I A Uréase ARY GLU CT 68° PNB HYD TCH PZA DCS Tb1 gel MC Nacl Mycobacterium tuberculosis complexe tuberculosis bovis africanum BCG - 37 >10j + X Croissance lente photochromogene kansasii marinum - + 30 x II Croissance lente scotochromogène szulgai gordonae xenopi flavescens + + 40 III non chromogène avium malmoense gastri terrae triviale - - IV Croissance rapide fortiutum peregrinum chelonae abscessus 28 3-5j

TESTS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Différentiation génétique du MTBC et des atypiques Extraction ADN bactérien de la culture Amplification de la cible par PCR Hybridation des amplicons aux sondes sur bandelettes Révélation par un conjugué marqué et son substrat Interprétation des signaux à l’aide d’une matrice

INNO-Lipa MYCOBACTERIA®

GenoType®MTBC M.tuberculosis BCG