Mutations et addictions à l’oncogène L3 UE REVETEMENT CUTANE Mutations et addictions à l’oncogène Brigitte GUBLER Responsable du laboratoire d’Oncobiologie Moléculaire

Plan Quelques définition Addiction Oncogène Le modèle historique de l’addiction oncogénique LMC et transcrit de fusion BCR-ABL Inhibiteur de l’activité tyrosine kinase Le mélanocyte et son environnement Les intéractions mélanocytes/kératinocytes L’homéostasie tissulaire Processus tumorale Instabilité génétique une caractéristique du mélanome ? Les cibles Protéines Kinases et facteurs des voies de signalisation Facteurs de transcription Suppresseurs de tumeurs. La vie d’une cellule: Survie Prolifération et apoptose cellulaire Les voie de signalisation Dérégulations et conséquences Les oncogènes et les thérapies ciblées Exemple de BRAF et KIT

Quelques définitions Addiction: L’addiction, ou dépendance désigne tout attachement nocif à une substance ou à une activité. désigne l'asservissement d'un sujet à une substance ou une activité Oncogène: 1) Un oncogène est un gène dont l'expression favorise la survenue d'un cancer. 2) L’oncogène résulte de la modification ou de la surexpression d'un gène normal, de ce fait baptisé proto-oncogène qui engendre une transformation physiologique de la cellule. Il peut s’agir de gène dont les propriétés des produits sont modifiées par mutation ou dont l’expression n’est pas corrélés au cycle cellulaire normale (gènes impliqué dans le contrôle de la division cellulaire). Addiction oncogénique: L’addiction oncogénique est la dépendance de la cellule tumorale vis-à-vis des modifications générés par l’oncogène en terme de prolifération de survie et d’invasion. La supression de l’oncogène induit une restauration partielle des propriétés natives de la cellule. On parle également de « driver oncogénique »

Le modèle historique de l’addiction oncogénique (1) 1) La leucémie myéloïde chronique (LMC) - 600 nouveaux cas par an en France. - Hémopathie maligne du groupe des Syndromes Myéloprolifératifs Chroniques. Prolifération myéloïde monoclonale sans blocage de maturation prédominant sur la lignée granuleuse. Anomalie acquise monoclonale d'une cellule souche pluripotente, Translocation t(9;22) ou chromosome Philadelphie avec assemblage du gène ABL (chr 9), avec le gène BCR (chr 22), - Gène dit BCR-ABL  transcrit de fusion BCR-ABL (ARNm)  nouvelle protéine à activité tyrosine kinase Colocalisation translocation t (9;22)(q34;q11) Caryotype :

Le modèle historique de l’addiction oncogénique (2) 2) Transcrits de fusion BCR-ABL BCR (22q11) 9 10 11-15 16 17 18 19 20 21 22 23 5 6 7 8 3 4 2 Exons alternatifs m-bcr 1 e1 cen tel M-bcr µ-bcr b2 b3 c3 c4 Fonction: - localisation cytoplasmique - Serine/threonine kinase possedant un domaine d’oligomérisation - activation cellulaire passant par les protéines Ras tel ABL (9q34) 1b 1a a2 a3 2 3 4 5 6 7 8 10 9 11 Breakpoint region cen Fonction - localisation nucléaire et cytoplasmique 1- Nucléaire: rôle majeur dans la régulation l’apoptose après dommages de l’ADN. 2- Cytoplasmic: Fonction possible dans les signaux d’adhésion cellulaire Fréquence 697 401 1767 227 m-BCR-ABL (p190): types de transcrits (ARNm chimérique) 2 1 4 >95% e1-a2 3 rare e1-a3 Fréquence M-BCR-ABL (p210): types de transcrits (ARNm chimérique) 55% 697 401 3270 227 2 11 4 b3-a2 3 12 13 14 3195 3091 3015 b2-a2 40% b3-a3 rare b2-a3

Le modèle historique de l’addiction oncogénique (3) Oligomérisation de la protéine de fusion BCR-ABL activité kinase d’ABL 1- Induction de la prolifération cellulaire (Ras/MAPK) 2- Inhibition de l’ apoptose ( la production de bcl-2) 3- Anomalies d’adhésion cellulaire: perte d’adhérence aux cellules stromales (prolifération anarchique des progéniteurs leucémiques) 3) L’Imatinib (Glivec®): Inhibiteur de l’activité tyrosine kinase 1996: Identification d’un inhibiteur des molécules à activité tyrosine kinase (TK) - agit au niveau de la poche ATP de la portion ABL de BCR-ABL aucun effet inhibiteur sur l’activité TK d’autres récepteurs (VEGFR et EGFR). 1998: Introduction de cet inhibiteur (initialement appelé CGP57148, STI571 puis l’imatinib mésylate) en clinique.

Le mélanocyte et son environnement Le mélanocyte: cellule à l’interface derme/épiderme responsable de la synthèse de mélanine. Réponse au stress Génotoxique UV induit Kératinocytes UV ↗P53 EDN1 bFGF KITL EDNR FGFR KIT NRAS BRAF MAPK MITF Fonctions Mélanogenèse Cycle cellulaire Prolifération Survie Apoptose PKC EDN1 = endothéline B-FGF =basis fibroblast growth factor KIT = CD117, SCF-R D’après Graeme Walker and Elke Hacker (2011). Ultraviolet Light as a Modulator of Melanoma Development, 2) « Dialogue » entre le mélanocyte et son microenvironnement est essentiel à l’homéostasie tissulaire. 3) Rupture du dialogue, signature du début du processus oncogénique Peau normale Epiderme Derme

Du mélanocyte au naevus au mélanome (1) 1) Les étapes Vanessa Gray-Schopfer, et al Nature 445, 851-857(22 February 2007) Peau normale Naevus Cellules de naevus atypiques Cellules de naevus Derme Epiderme Derme Epiderme Plusieurs étapes dans le processus de lésion mélanocytaire chacune marquée par l’émergence d’un nouveau clone possédant des avantages de croissance a, Peau normal: distribution homogène des mélanocytes b, Naevus bénin mélanocytaire, augmentation du nombre de mélanocytes (jonctionnel, dermique ou composé). Certain sont displasiques avec des mélanocytes morphologiquement atypiques. c, Phase de croissance radiale (horizontale, RGP) du mélanome = stade de tumeur primaire. d, Phase de croissance verticale (VGP) du melanome. Première étape ayant un potentiel malin. Mélanome RGP Mélanome VGP Dissémination pagétoïde Mélanome Dissémination pagétoïde Derme Epiderme Derme Epiderme Epiderme Derme

Du mélanocyte au naevus au mélanome (2) L’oncogenèse se caractérise initialement par l’affranchissement progressif de la cellules de son environnement tissulaire. 2) Comment s’établit le processus oncogénique? L’apparition d’un cancer = processus qui s’étend sur de nombreuses années. - C’est une maladie génétique des cellules somatiques. - La tumeur a pour origine une unique cellule qui s’est « déréglée ». Acquisition progressive par la cellule de mutations successives lui conférant des propriétés nouvelles (résistance, proliférative …) La carcinogenèse = phénomène à plusieurs étapes, par un processus cumulatif d'événements mutationnels interdépendants. Par activation d’oncogènes (gènes intervenant dans les voies d’activation et/ou le contrôle de la prolifération cellulaire) et par inactivation d'anti-oncogènes (gènes suppresseurs de tumeur, contrôlant l'intégrité du génome). Le développement oncogénique reste un événement rare comparé au nombre d’agressions subies par les cellules au cours leur vie.

Instabilité génétique une caractéristique du mélanome ? (1) Le mélanome est caractérisé par l’abondance et la variété des mutations somatiques. Les cibles de ces mutations sont les gènes codant des protéines Kinases, des facteurs des voies de signalisation majeures intracellulaires, des facteurs de transcription ou des suppresseurs de tumeurs. Les mutations ponctuelles (plus que les délétion ou duplication) semblent les abérations les plus décisives pour la progression. De nombreuses mutations des mélanomes ont souvent une signature UV et concerne les gènes codant pour les protéines de réparation de l’ADN. Gènes Altérations Fréquence Sous-type de mélanome concerné Voies affectées Kinase ou facteurs des voies de signalisation BRAF Mutation ponctuelle 50% Tous types et plus particulièrement les mélanomes nodulaires et superficiels extensifs MAPK NRAS 20% MAPK, PI3K et RALGDS KIT 1% Mélanomes acrolentigineux (10%), muqueux (10%), plus rarement lentigo malin MAPK et PI3K CDK4 Mutation ponctuelle ou amplification 5% Tous types Cycle cellulaire CCND1 Amplification 10% ERBB4 15-20% PI3K

Instabilité génétique une caractéristique du mélanome ? (2) Gènes Altérations Fréquence Sous-type de mélanome concerné Voies affectées Kinase ou facteurs des voies de signalisation AKT1, AKT2 et AKT3 Mutation ponctuelle ou amplification <1% Mutation ponctuelle 25% amplification (AKT3) Tous types PI3K NEDD9 Amplification 50-60% Protéines de structure GNAQ Mutation ponctuelle <1% Mélanome uvéal (40%) Voie PKC GNA11 Facteurs de transcription MITF 20% Lignage mélanocytaire et cycle cellulaire MYC Cycle cellulaire ETV1 15% Voie MITF Suppresseur de tumeur CDKN2A Ou délétion 30% TP53 5% BAP1 Mélanome uvéal (80%) BRCA1 PTEN ou délétion 50-60% Mutation ponctuelle ou délétion hétérozygote. 10% délétion homozygote

Transcription de gènes Progression du cycle cellulaire La vie d’une cellule: Fonctions, survie, prolifération et apoptose cellulaire 1) Les voies de signalisation passant par KIT et les récepteurs de type HER P16 BRAF MEK ERK CCND1 CDK4/6 NRAS Prolifération P KIT-L Transcription de gènes PKC F. Transcription c-myc, c-fos, c-jun STATs AP1 P HER-L 50% 8% 20% 5% 15% 40% Délété 10% 1-3% KIT HER (human EGF receptor) PI3K AKT mTOR PTEN Progression du cycle cellulaire Apoptose BAD

La vie d’une cellule: Fonctions, survie, prolifération et apoptose cellulaire 2) Dérégulations et conséquences - Autonomisation du recepteur - Activation constitutive des protéines de signalisation en absence de signal en amont Cascade de signalisation Activation de Gènes Angiogenèse Protection vis-à vis de signaux pro-apoptotiques Prolifération cellulaire - Perte de contrôle du cycle cellulaire - Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance M S G1 G2 Perte d’adhérence cellulaire Migration Capacité d’invasion Métastase Dédifférenciation immortalisation Les voies de la signalisation comme cible pour le développement de nouvelles molécules anticancéreuses.

Exemple du récepteur KIT 1) Structure et mutation Domaine extracellulaire Fréquence des mutations (%) K550N 2 Y553N 2 Del554-559 2 W557R 5 K558N 2 V559A/DAG 11 V560D 2 N566D 2 V569G 2 Del566-572 2 N566K 2 L576P 34 Del579 2 Insert/Dup583 2 NRAS P KIT-L Voie RAS/MAPK Prolifération Voie PI3K/AKT Cycle cellulaire Apoptose Les mutations favorise directement ou indirectement l’activité tyrosine kinase de KIT Domaine juxtamembranaire Exon 11 Domaine Kinase I Exon 13 K642E 15 R634W 2 D816V/H 6 Y823D 2 D820Y 2 N822I 2 Domaine Kinase II Exon 17 Exon 18 A829P 2 I841V 2 Représentation schématique du récepteur tyrosine Kinase KIT et la fréquence des mutations. Cinq domaines extracellulaires Ig-like permettent la fixation du ligan de kit, Stem-Cell-Factor (SCF). Woodman SE , Michael A. Biochemical Pharmacology 2010. 80(5) 568-574

Exemple du récepteur KIT 1) Traitement ciblant les mélanomes avec mutation de KIT Imatinib agit comme un analogue de l ’ATP et bloque le site TK Richard D. et al, JAMA. 2011;305(22):2327-2334 Imatinib N-[4-méthyl-3-[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]- phenyl]benzamide méthanesulfonate

Exemple de BRAF 1) BRAF: facteurs de la voie de signalisation des MAPK BRAF: - Protéine 766 aa 84,4 KDa - Famille des Serine/Threonine Kinases (superfamille RAF) - proto-oncogene BRAF intervient dans la voie RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK responsable de la transduction des signaux mitogéniques (des récepteurs membranaires vers le noyau) V600 ATG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 199 102 264 104 103 149 120 160 37 137 118 85 177 47 119 132 135 290 STOP 74353 15238 25613 829 6399 930 5894 6723 4390 1327 3500 902 22678 793 3856 9340 5041 2) BRAF: activation BRAF sauvage BRAF V600E

Exemple de BRAF 3) Patients BRAFV600E: 50% des mélanomes cutanés Zelboraf® = Vemurafenib (aussi connu sous les noms de PLX4032, RG7204 ou RO5185426) BRAF-V600E + Zelboraf®

Conclusion La tumeur est classée, non plus uniquement selon des critères cliniques, radiologiques et anatomopathologiques traditionnels, mais aussi selon des critères biologiques ou moléculaires caractéristiques de la transformation tumorale. Importance d’une cartographie génétique de la tumeur. Les oncogènes, un avantage pour la tumeur mais aussi un potentiel atout thérapeutique pour le clinicien. La prise en charge des cancers demain = combiner les thérapies ciblées Eggermont, Ann Oncol 2010