Tau, Phospho-Tau et A42 dans le LCR Des nouveaux marqueurs de la maladie d Alzheimer Le diagnostic clinique des maladies neurodegeneratives peut dejà utiliser certains marqueurs biologiques pour augmenter sa specificite et sa sensibilite.

Les marqueurs tissulaires du SNC Diagnostic de certitude Analyse neuropathologique donc post-mortem Depôts amyloïdes A42 Degenerescence neurofibrillaire Tau + Le diagnostic de certitude de la maladie d Alzheimer (MA) se fait actuellement uniquement sur des criteres anatomopathologiques et donc en post-mortem. Les criteres sont la presence concomitante de deux lesions caracteristiques : les depôts amyloides (agregats extra-cellulaires constitues d un peptide Ab42) et la degenerescence neuronale (DNF, agregats intraneuronaux composes essentiellement d une accumulation de proteine tau sous forme hyperphosphorylee). MALADIE D ALZHEIMER 3

Marqueurs biologiques de la maladie d Alzheimer Les marqueurs biologiques precoces Les marqueurs Tau Phospho-Tau A42 Le liquide biologique utilise: Le LCR (liquide cephalo rachidien) Lors de la consultation du patient, l examen clinique, l IRM, la neuropsychologie apportent un certain nombre d arguments qui permettent de poser un diagnostic en faveur de la maladie d Alzheimer. Cependant, le diagnostic reste incertain suite aux nombreuses atypies ou pour une maladie neurodegenerative en debut d evolution. L interêt des biomarqueurs est d apporter un argument de plus au clinicien pour le diagnostic de ces demences atypiques et d ecarter une maladie eventuellement curable (encephalopathies). Le diagnostic biologique actuel est base sur le dosage dans le Liquide Cephalorachidien (LCR) de constituants normaux qui varient lors du developpement de la maladie d Alzheimer. Ces constituants sont les proteines Tau totales et leurs formes phosphorylees (stigmates moleculaires de la lesion intracellulaire de type DNF) et le peptide Ab42 (stigmate moleculaire de la lesion extracellulaire amyloide).

TAU : une proteine associee aux microtubules Neurone neurofilaments microtubules Transport Axonal tubuline La proteine Tau non phosphorylee permet l assemblage des microtubules à partir de la tubuline La proteine Tau phosphorylee conduit au desassemblage des microtubules à l autre extremite. Ainsi l equilibre entre ces deux formes de proteine Tau permet un transport axonal correct dans le neurone, essentiel pour son bon fonctionnement et donc sa survie. Neurone microtubules tau GTP tubuline synapse tau P tubuline AXONE GDP tubuline

La deregulation de la phosphorylation de Tau au cœur de la DNF Normale Tau P N-ter P P P P P P Thr 181 Domaines de liaison P P P Chez un sujet sain, Tau peut-être phosphorylee sur les sites dits normaux (en jaune). Mais pour une proteine donnee seuls quelques sites sont phosphoryles. Ces sites peuvent être reconnus par des anticorps specifiques (ex AT270 pour Thr181) Au cours du processus de degenerescence neurofibrillaire, Tau est hyperphosphorylee : Pour une proteine Tau donnee, plus de sites normaux de phosphorylation sont phosphoryles De plus, il y a apparition de nouveaux sites de phosphorylations (en rouge) AT270 C-ter P = DNF Hyper phosphorylation Phosphorylation Anormale +

Accumulation et agregation La deregulation du metabolisme du precurseur du peptide amyloïde (APP) au coeur de la pathologie amyloide Espace extramembranaire Membrane plasmique Cytoplasme APP NH2 COOH CTF Voie non amyloidogene a-secretase APP CTF  NH2 COOH La pathologie amyloïde Le peptide Ab42 provient du clivage d un precurseur proteique transmembranaire APP. Chez un sujet normal, la voie metabolique majeure de l APP est dite non amyloïdogene : il s agit d un clivage . Chez un sujet Alzheimer, la voie amyloïdogene devient majeure : APP subit alors deux clivages successifs ê et g qui conduisent à la formation de Ab42 qui en s accumulant s agrege en plaques amyloïdes. Voie amyloidogene g-secretase -secretase Alzheimer A40 42 Accumulation et agregation

Conditions de prelevement des echantillons Ponction lombaire Prelevement sur un tube en polypropylene Acheminement en quelques heures au laboratoire Au laboratoire : centrifugation, conservation à -80°C Quelques precautions lors du prelevement doivent être respectees : le LCR doit être recueilli sur des tubes en polypropylene pour eviter l adhesion sur la paroi des tubes des composants à doser ce qui conduirait à des valeurs faussement abaissees lors des dosages ; puis le prelevement doit être achemine au laboratoire en quelques heures (24 heures maximum) ; enfin, il sera centrifuge, aliquote (par 300µl) et pourra ensuite être conserve plusieurs mois à -80°C.

Principe test ELISA ± Le dosage fait appel à une technique immunoenzymatique de type ELISA . Le kit utilise à Lille est distribue par la societe INNOGENETICS (Belgique).

dans l espace extracellulaire INNOTEST hTau ( total) Anticorps utilises pour le dosage des Tau totales HT7 BT2 AT120 Blennow et al, Mol Chem Neuropathol 1995;26:231 Repond à la question Y a t il mort neuronale? Le dosages des proteines tau totales permet de repondre à la question : y a-t-il mort neuronale? En effet, quand le neurone meurt, la proteine Tau intraneuronale est liberee dans le milieu extracellulaire, passe dans le LCR où sa concentration augmente. Si oui, hTau  car libere dans l espace extracellulaire

INNOTEST  Amyloide (1-42) Anticorps utilises pour le dosage de A 1-42 3D6 1 42 21F12 Vanderstichele et al, 1998 Repond à la question Y a-t-il formation de depots amyloides? Le dosage du peptide Ab42 permet de repondre à la question : y a-t-il des depôts amyloides dans le cerveau de mon patient? En effet en cas de presence de depôts amyloides, le peptide Ab42 est sequestre dans les agregats et sa concentration dans le LCR diminue. Si oui, Ab42  car piege dans les agregats

INNOTEST phospho Tau (181P) ELISA for CSF phospho tau (P-Thr181) AT270 HT7 P Vanmechelen et al, Neurosci Lett 2000;285:49 Repond à la question Y a t il formation de DNF? Le dosage des proteines Tau phosphorylees permet de repondre à la question : y a-t-il de la degenerescence neurofibrillaire (DNF) chez mon patient. En effet, la DNF est constituee essentiellement de proteines Tau hyperphosphorylees qui s accumulent. Les neurones faisant de la DNF vont mourir et liberer dans le milieu extracellulaire une grande quantite de ces proteines Tau phosphoryleesq dont la concentration va donc augmenter dans le LCR. Si oui, phosphoTau  car tau est hyperphosphoryle

Tau, Ab42 et Phospho-Tau : valeurs de reference dans le LCR INNOTEST INNOTEST INNOTEST Age Tau Aß42 Phospho-Tau* (pg/ml) (pg/ml) 61±18 263 ± 164 794 ± 218 35 (18-87) 21-50 ans 136 ± 89 792 ± 182 51-70ans 243 ± 127 790 ± 228 MMSE = 29.2 ± 0.92 Sjögren et al : Tau and Aß42 in CSF during Aging (2001) ClinicalChemistry 47:10 *Schoonenboom et al : Ab42 and phosphorylated Tau in CSF as markers for early-onset Alzheimer disease (2004) Neurology 62 : 1580 Les valeurs de reference de Tau, phospho-Tau et Ab42 ont ete determinees dans la litterature

Variations des concentration de Tau et A42 dans le LCR de patients Alzheimer La proteine Tau totale augmente La proteine Tau phosphorylee augmente Le peptide -amyloid(1-42) diminue JAMA . 2003; 289: 2094-2103. Meta-analysis involving 17 studies of CSF ß-amyloid and 34 studies of CSF tau. THE LANCET Neurology Vol2. October 2003 CSF markers for incipient AD. Chez les patients atteints de MA, les concentrations dans le LCR des proteines Tau totales et des proteines tau phosphorylees augmentent et celle de Ab42 diminue

Diagnostic differentiel Dr Blennow, Clinical Laboratory International, Oct.2001: 8-10 Pathologie hTau total Tau -181P Beta-amyloid(1-42) Senescence normal Normal (< 450 Normal (< 60 Normal (> 500 pg/ml) pg/ml) pg/ml) Mal. Alzheimer Ú Ú ØØ modere modere Depression N N N Mal. Parkinson N N N Demence alcoolique N N N Dem. fronto-temporale N ou Ú faible N ou Ø faible N ou Ø faible Dem. Corps Lewy N ou Ú faible N Ø faible Le dosage simultane des 3 marqueurs permet de faire le diagnostic differentiel de la MA avec d autres maladies neurologiques (depression, maladie de Parkinson), d autres demences (alcoolique, vasculaire..) à modere Mal. Creutzfeldt-Jakob ÚÚÚ Ú Ø N ou Acc.Vascul.Cerebral ÚÚ transitoire N N Dem. vasculaire Data divergentes N N ou Ø faible

Amelioration de la sensibilite du test = seuil A variable 500 1000 1500 2000 2500 Tau (pg/ml) Diagnosis Correctly classified by line : 86% discriminant analysis A42=240 + 1.18 Tau AD (n=150) CON (n=100) ND (n=84) A42 (pg/ml) L  analyse combinee des deux marqueurs a permis de determiner une ligne de reference seuil : Ab42 = 240 +1.18 Tau qui permet de caracteriser correctement 86% des echantillons selon l etiquette diagnostique pre-etablie par chaque centre inclus dans l  etude multicentrique. * Composite Figure from Hulstaert et al. Neurology 1999;52:1555-1562

IATI Index MA vs Contrôles Innotest Amyloid Tau Index Tau mesuree : xxx pg/ml  reference relative A42 : =240 +1.18[Tau] A42 mesuree : yyy pg/ml IATI = A42 mesuree / reference relative d apres F.Hulstaert et coll. IATI Index > 1 Normal (Neurology 1999;52:1555-1562) On compare la concentration de Ab42 mesuree à la reference relative calculee à partir des concentrations de Tau. Si Ab42 diminue (Ab42< reference relative) [IATI<1], c est pathologique Si Ab42 ne diminue pas (Ab42> reference relative), c est normal.

IATI > 1.2 pronostic favorable Triage MCI patients IATI > 1.2 pronostic favorable IATI < 0.8 degenerescence neuronale anormale IATI < 0.8 & [pTau] > 60 Profil pathologique Alzheimer possible L utilisation combinee de l index IATI et des concentrations en Phospho-Tau permet de separer les patients en 4 zones : En haut à gauche : les patients sains : IATI>1 et Ph-Tau<60 pg/ml (Con pour contrôles) Remarque : il n y a aucun cas Alzheimer dans cette zone On y trouve la majorite des MCI stables En bas à droite : les patients Alzheimer : IATI<0,8 et Ph-Tau > 60 pg/ml Rq : aucun patient sain n est dans cette zone On y trouve la majorite des MCI-preAlzheimer Les deux autres zones : Les dosages ne permettent pas de conclure : on y trouve quelques ctrls, quelques MCI et des Alzheimer Donnees non publiees - resultats d etudes multicentriques

Conclusions C est l utilisation conjointe des trois dosages hTau, pHospho-Tau et Ab42 qui permet de distinguer des patients atteints de la maladie d Alzheimer des patients atteints d autres demences ou autres pathologies neurologiques En conclusion, les trois dosages A42 , tau et Phospho-Tau sont des marqueurs prometteurs de la maladie d Alzheimer.

Conclusion II: Diagnostic Differentiel DFT, DCB N = Normal B = Border P = Pathologie MCJ Niveau N B P P++ Tau phosphorylation N B P DCB: degenerescence corticobasale DFT: Degenerescence fronto-temporale DCL: Demence à corps de Lewy MCI: troubles cognitifs debutants MCJ: maladie de Creutzfeld-Jacob DCL A 42 Niveau N B P Alzheimer, du MCI à la demence

Clinique Neurologique C Dr. S. Bombois Pr. F. Pasquier UF de Neurobiologie Hopital R. Salengro Dr. S. Schraen Dr. I. Vuillaume Pr. B. Sablonniere Unite INSERM U422 Groupe VCDN Dr. S. Schraen Pr. B. Sablonniere Dr A. Delacourte Dr. L. Buee Ont participé à cette étude: Clinique Neurologique C Dr. S. Bombois Pr. F. Pasquier