Réponse innée du SI : 1ère ligne de défense (↑ réponse anti-microbienne) Vitamine D: rôle majeur vis-à-vis de M. tuberculosis Suite de l’article de Science (vol 311-24 mars 2006)

Voie TLR antimicrobienne et vitamine D Observations précédentes Lipopeptide synthétique de 19kDA dérivé de M. tuberculosis Activation de la voie vitamine D dépendante conduisant à l’induction de la cathelicidin Monocytes (TLR2/1) 25- hydroxy-vitamin D3 (25D3) CYP27b1-hydroxylase 1,25D3 Addition de 1,25D3 exogène ↑ activité anti-M. tuberculosis ↑ synthèse de cathelicidin

But de l’étude Savoir si l’activation de l’induction de cathelicidin par la vitamine D est requise pour l’effet antimicrobien de celle-ci sur la bactérie intracellulaire M. tuberculosis Par une approche de silencing de la cathelicidin

Validation du modèle expérimental Co-culture de cellules de monocytes humains (THP-1) et de M.tuberculosis avirulent souche H37Ra en présence ou non de 1,25 D3 (3 jours) Mesure de la multiplication bactérienne Activité du 1,25 D3 plutôt bactéricide: pop à 3 jours < inoculum 1-Vérifier l’effet inhibiteur du 1,25 D3 sur la multiplication des bactéries.

Validation du modèle expérimental 2-Vérifier la production de cathelicidin en présence de1,25 D3 Mesure par qPCR de la quantité des transcrits cathelicidin et Cyp24 avec normalisation sur 36B4 (highly conserved integral ribosomal protein) Forte induction des mRNA Cyp24 (Récepteur de la vitamine D) Induction des mRNA cathelicidin (x48 à x140 en présence de 1,25D3) corrélé à la présence de la protéine et à son augmentation. La lignée cellulaire THP-1 peut être utilisée pour étudier la relation entre l’activité antimicrobienne du au 1,25D3 et l’expression de la cathelicidin

Inactivation de la cathelicidin par siRNA Le siRNA cathelicidin inhibe bien la transcription de mRNA cathelicidin en présence de 1,25D3 et est bien spécifique de sa cible.

Inactivation de la cathelicidin par siRNA Le silencing de la cathelicidin conduit bien à l’absence d’induction de la protéine en présence de 1,25D3. Aucun effet de la transfection ou du traitement par le 1,25D3 n’est observé sur la production des protéines et ne peut expliquer l’absence de cathelicin. Validation de l’inavtivation.

Co-infection cellules silencées et M.Tuberculosis En présence de 1,25D3: la production de cathelicidin inhibe la croissance bactérienne de 40-50% son inactivation conduit à une meilleure survie L’effet anti-microbien de la vitamine D est bien en lien avec la production de cathelicidin

Conclusions - Perspectives Depuis plus de 20ans, différentes hypothèses pour l’action antimicrobienne du 1,25D3 par les monocytes et les macrophages contre M. tuberculmosis: -activation du PI3K et génération d’intermédiaires de l’oxygène réactifs -TACO (Tryptophan Aspartate-containing COat) protéine en association avec la vitamine D3 contrôleraient l’entrée et/ou la survie de M. tuberculosis L’induction de l’expression du peptide antimicrobien cathelicidin est nécessaire pour observer l’activité antimicrobienne du 1,25D3 dans les monocytes humains THP-1 contre la souche avirulente de M. tuberculosis. Valider ces résultats sur des souches virulentes. Possibilité de traitements complémentaires des patients avec de la vitamine D

Acidic ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) is a highly conserved integral ribosomal protein which is translationally controlled.1 Associated with the 60S ribosomal subunit, 36B4 has been implicated in ribosomal activities such as polypeptide synthesis, factor-dependent GTP hydrolysis, and binding of aminoacyl-tRNA.2 36B4 expression is relatively constant in both control and experimental conditions, thus rendering it useful as an internal control for gene expression assays.3