Coordonnateur: Will Home BCM111/113 TSB707 Les lipides Coordonnateur: Will Home Dans ce labo, voir comment extraire les lipides et les analyser par CCM

Lipides Rôles entreposage d'énergie (TAG) membranes (phospholipides + stérols) hormones (stéroïdes) vitamines (A, D, E et K) inflammation (prostaglandines) récognition cellulaire (glycolipides) signaux intracellulaires (phosphatidylinosotidols) Les lipides sont insolubles dans l’eau Solvants organiques: acétone, alcool, chloroforme et éther éthylique Exemples dans les notes de cours séance 6 ou livres/cours de biochimie et liens sur le site web

Séance 6 - Buts Analyser les lipides retrouvés dans le jaune d’œuf et dans les épinards. Familiarisation avec: techniques d’extraction des lipides techniques d’identification des lipides techniques de séparation des lipides Objectifs de la séance sur les lipides : - Extraire des lipides d’un jaune d’œuf. - Déterminer la quantité de lipides dans le jaune d’œuf. - Analyser les extraits lipidiques d’un jaune d’œuf et des feuilles d’épinard sur chromatographie sur couche mince. - Observer les résultats des révélateurs différents sur CCM. - Essayer d’identifier les lipides dans les extraits en comparant leur migration avec celle des standards. - Comparer vos résultats avec la littérature scientifique.

Séance 6 - manipulations Lipides Exercice 1: Extraction (jaune d’œuf) Exercice 2: Quantification Exercice 3: Séparation par CCM (labo sec) Compte rendu Objectifs de la séance sur les lipides : - Extraire des lipides d’un jaune d’œuf. - Déterminer la quantité de lipides dans le jaune d’œuf. - Analyser les extraits lipidiques d’un jaune d’œuf et des feuilles d’épinard sur chromatographie sur couche mince. - Observer les résultats des révélateurs différents sur CCM. - Essayer d’identifier les lipides dans les extraits en comparant leur migration avec celle des standards. - Comparer vos résultats avec la littérature scientifique.

Lipides Séparation et analyse hydrophobes certains ont aussi une partie hydrophile extraction requit l'utilisation des solvants organiques (souvent CHCl3:MeOH:H20) purification/analyse par chromatographie Les lipides sont insolubles dans l’eau Solvants organiques: acétone, alcool, chloroforme et éther éthylique Exemples dans les notes de cours séance 6 ou livres/cours de biochimie et liens sur le site web

Lipides Classification Triglycérides Phospholipides Stéroïdes Entreposage d’énergie Isolation Membranes cellulaires Membranes cellulaire Messagers chimiques Grande variation structurale, donc une importance très variée dans les organismes Lipides simples: Acides gras: Triglycérides: Lipides composés: Phospholipides: ressemblent aux triglycérides mais contiennent de l’acide phosphorique estérifié avec un alcool Sphingolipides: sphingomyéline  sphingosine remplace glycérol, système nerveux des animaux Glycolipides: système nerveux des animaux Lipoprotéines: transport des produits non-polaires ex.: lipides Dérivés lipidiques: Stéroïdes: chlestérol  précurseur de plusieurs autres stéroïdes; sels biliaires (acide cholique et deoxycholique), testostérone et progestérone Vitamines solubles dans les lipides: A, D, E et K, inclus dans les lipides en raison de leurs propriétés de solubilité

Lipides Phospholipides Sérine  phosphatidylsérine Choline  phosphatidylcholine (lécithine) Groupement peut varier donnant les classes de phospholipides Sont formés d’un glycérol lié à deux acides gras (variables) et à un groupement phosphate ± un autre groupe attaché

Lipides Intérêt médical: Maladies Liposomes Maladies : cholestérol élevé Liposomes : Applications médicales dans la livraison des médicaments (1- attrapper les médicaments, 2- relâcher dans le système) Les liposomes véhiculent des vitamines Maladies Liposomes

Exercice 1 Extraction des lipides du jaune d’œuf Vortex Méthode de Bligh et Dyer Couper une pipette de transfert de plastique pour prélever le jaune d’oeuf Bécher 50 ml à chaque balance, Tarer le tube Falcon 15 ml. Laisser le bécher sur la balance après. Chloroforme déjà 2:1, pipetter sous la hotte 3 rôles du chloroforme: extraire les lipides dénaturer les protéines permet la formation des 2 couches Récupération de la phase chloroforme: utiliser une pipette pasteur en verre + poire longer la parois du tube et traverser l’interphase 99% du MeOH est dans la phase aqueuse

Exercice 1 Extraction des lipides du jaune d’œuf Vortex Méthode de Bligh et Dyer Couper une pipette de transfert de plastique pour prélever le jaune d’oeuf Bécher 50 ml à chaque balance, Tarer le tube Falcon 15 ml. Laisser le bécher sur la balance après. Chloroforme déjà 2:1, pipetter sous la hotte 3 rôles du chloroforme: extraire les lipides dénaturer les protéines permet la formation des 2 couches Récupération de la phase chloroforme: utiliser une pipette pasteur en verre + poire longer la parois du tube et traverser l’interphase 99% du MeOH est dans la phase aqueuse

Interphase=protéines Lipides dans chloroforme Exercice 1 Extraction des lipides du jaune d’œuf ampoule à décanter Interphase=protéines Phase aqueuse Lipides dans chloroforme Méthode de Bligh et Dyer Couper une pipette de transfert de plastique pour prélever le jaune d’oeuf Bécher 50 ml à chaque balance, Tarer le tube Falcon 15 ml. Laisser le bécher sur la balance après. Chloroforme déjà 2:1, pipetter sous la hotte 3 rôles du chloroforme: extraire les lipides dénaturer les protéines permet la formation des 2 couches Récupération de la phase chloroforme: utiliser une pipette pasteur en verre + poire longer la parois du tube et traverser l’interphase 99% du MeOH est dans la phase aqueuse

Exercice 1 Extraction des lipides du jaune d’œuf Prélever >1ml Méthode de Bligh et Dyer Couper une pipette de transfert de plastique pour prélever le jaune d’oeuf Bécher 50 ml à chaque balance, Tarer le tube Falcon 15 ml. Laisser le bécher sur la balance après. Chloroforme déjà 2:1, pipetter sous la hotte 3 rôles du chloroforme: extraire les lipides dénaturer les protéines permet la formation des 2 couches Récupération de la phase chloroforme: utiliser une pipette pasteur en verre + poire longer la parois du tube et traverser l’interphase 99% du MeOH est dans la phase aqueuse

Exercice 1 Extraction des lipides du jaune d’œuf extrait lipidique Méthode de Bligh et Dyer Couper une pipette de transfert de plastique pour prélever le jaune d’oeuf Bécher 50 ml à chaque balance, Tarer le tube Falcon 15 ml. Laisser le bécher sur la balance après. Chloroforme déjà 2:1, pipetter sous la hotte 3 rôles du chloroforme: extraire les lipides dénaturer les protéines permet la formation des 2 couches Récupération de la phase chloroforme: utiliser une pipette pasteur en verre + poire longer la parois du tube et traverser l’interphase 99% du MeOH est dans la phase aqueuse extrait lipidique

Exercice 2 Estimation de la quantité de lipides dans le jaune d’œuf Poids cupule vide # d’équipe 1 ml de lipides dans CHCl3 Hotte (1 heure) Évaporation du CHCl3 Pipette  remplir - vider – remplir (avec mélange chloroforme/lipide) Comparer vos résultats avec ceux du tableau #3 Poids cupule + lipides Calcul % lipides

Exercice 3: Chromatographie (CCM) Vitesse de migration d’une substance Force d’entrainement du solvant Force de rétention (gel de silice) Voir les notes de cours pp. 5-8 et site web (animation) Choix du matériel: plaque (silice), cuve, support Choix du solvant: solvant mélange de polarités Interactions: intramoléculaires moments dipolaires liens hydrogènes liens ioniques liens covalents etc.

Exercice 3 (labo sec) séparation des phospholipides sur CCM analyse des lipides dans le jaune d’œuf et dans le épinard laboratoire sec, mais vous êtes responsable pour comprendre les manipulations CCM des sucres à la Sc. 10 (BCM111) Préparer un modèle sur papier avant le laboratoire. Une plaque/2 équipes – étiqueter # d’équipe + révélateur Déposer les échantillons : volume, espacement Ne pas tenir les eppendorfs dans les mains et fermer les bouchons – évaporation du CHCl3 Déposer 5 ul à la fois, laisser sécher avant d’en mettre plus (déposer 20 ul total) Dès que c’est prêt, remettre au démo

(mettre sous la plaque) Exercice 3 (labo sec) CCM Modèle sur papier (mettre sous la plaque) 1,5 cm X X X X X X X X X X X X X X X 20 cm ligne d’application de l’échantillon Préparer un modèle sur papier avant le laboratoire. Une plaque/2 équipes – étiqueter # d’équipe + révélateur Déposer les échantillons : volume, espacement Ne pas tenir les eppendorfs dans les mains et fermer les bouchons – évaporation du CHCl3 Déposer 5 ul à la fois, laisser sécher avant d’en mettre plus (déposer 20 ul total) Dès que c’est prêt, remettre au démo

Exercice 3 front de migration # Équipe, Révélateur front de migration Chromatographie : saturation, temps Solvant ratio 30 :34 :8 :35 = 30 ml chloroforme + 34 ml éthanol+ 8 ml eau+ 35 ml triéthylamine Dans chaque chambre à chromato sous la hotte Solvant: Chloroforme : H2O : Éthanol : Triéthylamine ( 30 : 34 : 8 : 35 )

Exercice 3: Résultats des CCM 3 révélateurs: bleu de molybdène, ninhydrine, rhodamine Bleu de molybdène (zinzade) phospholipides taches bleues Ninhydrine amines + acides aminés taches violacées Rhodamine tous les lipides taches fluorescentes(UV)

Exercice 3 Rf = Distance de migration de la Tache (milieu) Distance de migration du Solvant A B C D E F G S Après migration et coloration Calcul rapport de front (Rf) et analyses Prendre les 4 photos de la table T

Exercices 1-3 Sécurité conserver les solutions fermées + sur glace Chloroforme Matière toxique ayant des effets toxiques immédiats graves Soupçonné d’être cancérigène Solvants organiques

Exercices 1-3 Sécurité Conserver les solutions fermées + sur glace Chloroforme Matière toxique ayant des effets toxiques immédiats graves Soupçonné d’être cancérigène Solvants organiques

Exercices 1-3 Sécurité -pipette de transfert en verre = verre brisé -composte pour dechets organique (ne pas mettre dans les poubelles de table) Solvants organiques

Exercices 1-3 Sécurité Centrifuge -pipette de transfert en verre = verre brisé -composte pour dechets organique (ne pas mettre dans les poubelles de table) Centrifuge -balancer vos tubes Solvants organiques

Exercices 1-3 Centrifuge - si le rotor n’est pas balancé… La soucoupe volante vue hier était en fait un rotor débalancé. Solvants organiques

Exercices 1-3 Centrifuge - 3 modèles peu importe le modèle, 3750 rpm Solvants organiques

Permettant d’observer le lipide std Compte rendu Question 5: Lipide Standard Révélateur(s) Permettant d’observer le lipide std (B, N, R**) Jaune d’œuf observé (+,++,+++) Info litt. en % Épinard Info litt. en % PC Rf =____

Compte rendu - Q5 et Q7 % relative +++ + ++ jaune d'oeuf

Compte rendu Question 5: Question 7: Lipide Standard Révélateur(s) Permettant d’observer le lipide std (B, N, R**) Jaune d’œuf observé (+,++,+++) Info litt. en % Épinard Info litt. en % PC Rf =____ Révélateur(s) Permettant d’observer les taches (B, N, R**) Jaune d’œuf présence /absence (-,+,++,+++) Épinard Commentaires, explications, identification possibles, etc. Tache #__ Rf =_____

Compte rendu portez attention de clairement identifier les taches en question sur les CCMs (pistes d'oeuf et d'épinard) Question 5 (PC, PE, PI, PS et TAG) Question 7 (avec # du tableau de Q7)

Questions? BCM111/113, TSB707 Les lipides Dans ce labo, voir comment extraire les lipides et les analyser par CCM