Correction of junctional epidermolysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells Fulvio Mavilio1, Graziella Pellegrini1,2, Stefano Ferrari2, Francesca Di Nunzio1, Enzo Di Iorio2, Alessandra Recchia1, Giulietta Maruggi1, Giuliana Ferrari3, Elena Provasi4, Chiara Bonini4, Sergio Capurro5, Andrea Conti6, Cristina Magnoni6, Alberto Giannetti6 & Michele De Luca1,2 1Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Via Campi 287, 41100 Modena, Italy. 2Epithelial Stem Cell Research Center, Veneto Eye Bank Foundation, H. SS Giovanni and Paolo, Castello 6777, 30100 Venice, Italy. 3Istituto Scientifico H. San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy (HSRTIGET) and Vita-Salute University, and 4Cancer Immunotherapy and Gene Therapy Program, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italy. 5Division of Plastic Surgery, H. San Martino, Largo Rosanna Benzi 10, 16132 Genova, Italy. 6Department of Internal Medicine, University of Modena and Reggio Emilia, Via del Pozzo 71, 41100 Modena, Italy.

Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Gp des Maladie Bulleuses Héréditaire Bulles ou érosions spontanées ou suite à trauma minimes 3 gp selon niveau de clivage dans zone dermo-épidermique EB jonctionnelles : pars lucida Mutations affectant les ligands d’adhésion épithéliale laminine-5 intégrine α6β4 BP180 Mutation prédominante : gène LAMB3

Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Patient de 36 ans (KEP25) atteint de EBJNL Mutation dbl hétérozygote LAMB3- / LAMB3 (E210K) Décollements cutanés depuis naissance Surinfection des lésions Candidat à la transplantation de de cellules souches épidermiques génétiquement modifiées

Obtention des cellules transfectées Biopsie-punch trypsinées Culture sur tapis de cellules nourricières 3T3-J2 irradiées Test « clonogéniques » Holoclones : colonies larges à croissance rapide, <5% des colonies à différenciation terminale Paraclones : petites colonies à différenciation terminale et prolifération limitée Meroclones : mélange

Obtention des cellules transfectées Construction rétrovirale Squelette du vecteur MFG LTR du MLV cDNA complet de LAMB3 Transfection de cellules Gp+envAm12 Coculture cellules vectrices + holoclones

Efficacité de transduction par MFG-LAMB3

Southern Blot Kératinocytes témoin Kératinocytes KEP25 non transfectés Kératinocytes KEP25 transfectés Bandes de taille attendue : pas de réarrangement proviral Fragments de LAMB3 endogènes

Surexpression importante (x5) de l’ARN LAMB3 Northern Blot Kératinocytes témoin Kératinocytes KEP25 non transfectés Kératinocytes KEP25 transfectés Surexpression importante (x5) de l’ARN LAMB3 ARN LAMB3 endogène

Expression du trimère comparable aux kératinocytes témoin Immunoprécipitation Kératinocytes témoin Kératinocytes KEP25 non transfectés Kératinocytes KEP25 transfectés Expression du trimère comparable aux kératinocytes témoin Expression du transgène persistante (>120 doublements)

Greffe de tissus transgénique Greffe au niveau région antéro-supérieure de la jambe Exérèse chirurgicale épiderme lésé Greffe de tissus GM de 55cm2 4 à gauche 5 à droite Régénération normale à J8 Epiderme normal au cours de la première année Pas de lésions après stress mécanique

Reconstitution d’un épithélium complètement différencié Analyse du greffon Hybridation in situ PCR semi-Q Transduction  complète Reconstitution d’un épithélium complètement différencié

Analyse du greffon par immunofluorescence Expression normalement diminuée dans EBJ Expression du FT ΔNp63 corrélée à capacité de renouvellement de l’épiderme

Absence de réponse humorale ou cellulaire contre LAM5-β3 endogène Mutation LAMB3 E210K permet synthèse d’une faible quantité de LAM5-β3 anormale Analyse mathématique du potentiel de présentation de tous les 9-mer recouvrant la mutation Phénotype HLA-I : HLA-A*01/*0301 HLA-B*3503/*3801 HLA-Cw*0401/*1203 Score potentiel de présentation faible Potentiel de réponse humorale Phénotype HLA-II : DRB1*1101/*1301 DQB1*0301/*0603 Faible potentiel de réponse

Exploration de l’immunité anti LAM5-β3 Recherche d’Ac anti- LAM5-β3

Exploration de l’immunité anti LAM5-β3 Test de cytotoxicité PBMC stimulés par LT autologues irradiés transfectés par MFG-LAMB3 LT allogéniques irradiés Activité lytique évaluée 10 jours plus tard par relarguage 51Cr

Exploration de l’immunité anti LAM5-β3 Libération d’IFN-γ Aucun signe histologique d’infiltrat inflammatoire dans les biopsies au cours du suivi

Innocuité du traitement Analyse des sites d’intégration dans le génome Librairies de jonctions vecteur / génome par Linker-Mediated Nested PCR Séquençage des sites de jonctions

Innocuité du traitement Analyse des sites d’intégration dans le génome 36 sites d’intégration à 1 mois 26 sites d’intégration à 4 mois 3 sites d’intégration aux deux temps Plus de 30% des intégrations à 10kb des sites d’initiation de transcription (TSS)

Intégration préférentielle des gamma-rétrovirus

Discussion Des cellules souches de kératinocytes sont capables de régénérer un épiderme auto-renouvelé in vivo Progéniteurs ont une activité transitoire d’environ 1 mois Greffe de peau autologue chez les brulés Rejet dans le premier mois Quasi jamais de rejet après 2 mois Rejet précoce quand les CSK ne sont pas maintenues dans le greffon Remplacement pas à pas de tout l'épiderme est envisageable Procédé Timedsurgery peu invasif Sous anesthésie locale Programmé sur 2-3 ans pour KEP25 Preuve de l’inocuité du traitement Génotoxicité observé dans un seul protocole de traitement de l’X-SCID Pas de signes d’expansion clonale ou de sites spécifiques d’insertion in vivo Pas de prolifération clonale reliée à un site d’insertion particulier in vitro Récurrence des sites d’insertion à différentes zones et à différents temps suggère que les nombre de sites chez un patient est fini