Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010 Soutenance de thèse

Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal 2

Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? neurite corps cellulaire (soma) noyau Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] cône de croissance 3

Le cône de croissance : structure et fonctions chimio-répulsionchimio-attraction microtubule filament d’actine faisceau de filaments d’actine filopode lamellipode axone cône de croissance 4

Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] Adhésion cellulaire et différenciation neuronale :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Distribution de l’énergie de surface ? 1 µm ΔEΔE Deux paramètres : Nanorugosité Gradients locaux surface E3E3 E1E1 E2E2 E4E4 E5E5 5

Partie I Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la neuritogénèse 6

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 7

Technique de modification du verre 8

Stratégies de modification du verre par diverses molécules PLL n EDA 9

Les cellules PC12 :  sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.  voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencient sous traitement au NGF. Cellule PC jours Cellules PC12 - à l’ensemencement Les cellules PC12 :  sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. Cellule PC12 NGF 6 jours Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale 10

Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF sans NGF 6 jours avec NGF 6 jours 11

6 jours verre/EDA Sur PLL :Sur EDA : Neuritogénèse induite par effet de surface sans NGF 6 jours 12 Gradients locaux dans les énergies d’adhésion

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 13

Expression du marqueur neuronal : MAP1B 14

verre/PLL sans NGF témoin négatif verre/PLL avec NGF témoin positif verre/EDA sans NGF Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture) 15

avec NGF 50 µm sans NGF PEDA : 6 jours PEDA : 6 jours (sans NGF) Expression du marqueur neuronal : Tau 50 µm25 µm 50 µm actine Tau ADN 16

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 17

CH 3 NH 2 NH 3 + NH 2 Influence de la nature des terminaisons Biopolymères (acides aminés)Alkylsiloxanes peu ou pas de neuritogénèseneuritogénèse élevée PLLEDA PLOHTMS 18

PLL EDA HTMS PLO Microscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50) 10 µm 19

Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Conclusions  Influence de facteurs externes Limites Neuritogénèse obtenue par effet de surface Expression de marqueurs neuronaux  Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion  Reproduction de l’effet du NGF 20

Partie II Identification des paramètres de surfaces critiques à la réponse cellulaire 21

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 22

Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes très ordonnée conformation all-trans Classe 1 partiellement ordonnée perte des liaisons latérales Classe 2 très désordonnée hétérogénéité chimique accrue Classe 3 23

Spectroscopie vibrationnelle :  génération de fréquence somme (SFG) Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : substrat État vibrationnel excité ω IR ω Vis ω SFG État fondamental État virtuel  modèle Owens-Wendt composantes dispersive/apolaire énergie d’adhésion solide-liquide composantes non-dispersive/polaire 24

Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H) 25

Spectres SFG des substrats dans la région C-H ODMS 1 ; ODMS 2 ; HTMS M :  Formation d’une monocouche désordonnée Classe 2 & Classe 3 OTS (θ = 110°) ODMS 1 (θ = 77°) HTMS H (θ = 104°) HTMS M (θ = 56°) ODMS 2 (θ = 96°) Classe 1 OTS ; HTMS H :  Formation d’une monocouche très ordonnée 26

 modèle Owens-Wendt Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : Spectroscopie vibrationnelle :  génération de fréquence somme (SFG) composantes dispersive/apolaire énergie d’adhésion solide-liquide composantes non-dispersive/polaire substrat État vibrationnel excité ω IR ω Vis ω SFG État fondamental État virtuel 27

Estimation des énergies libres de surface Classe 2 (▲) :  présence de gradients locaux dans les E adhésion Classe 3 (#) :  hétérogénéités chimiques accrues 28 Classe 1 (¤) :  Distribution homogène de l’énergie (  s ≈  d )

pas d’adhésion  agrégats cellulaires flottant adhésion limitée  quelques neurites 200 µm Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher) Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfaces après 48h de culture sans NGF 200 µm classe 1classe 2classe 3 adhésion renforcée  forte croissance neuritique surface très ordonnéesurface (dés)ordonnéesurface très désordonnée 29

Identification du facteur critique :  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques E adhésion (classe 3) > E adhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γ s ? Identification du facteur critique :  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques E adhésion (classe 3) > E adhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γ s ? Conclusions 30

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 31

Modification du verre par des aminosilanes Classe 2Classe ??? État ordonné État désordonné ADMSAPTMSEDA DETAPEDA Monométhoxy-silaneTriméthoxy-silanes 32

EDAPEDA ADMSAPTMS eda & peda :  très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms :  plus homogènes (Classe 2) deta :??? Analyses des surfaces NH 2 : théorie de Zisman Liquides tests énergies critiques γ c ± 2 mN m -1 33

ADMSAPTMS Analyses des surfaces NH 2 : théorie de Owens – Wendt Liquides tests énergies critiques γ c 34 eda & peda :  très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms :  plus homogènes (Classe 2) deta :??? ± 2 mN m -1

Cellules en culture sur les surfaces NH 2 /OH après 24h de culture sans NGF classe 2 différenciation : + cas particulier du deta classe 2 classe 3 différenciation :

La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. Conclusions 36

Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 37

AFM : cellules PC12 sur verre/EDA. 150 nm 38

Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B. témoin [cytochalasine] = 5 µM 39

Conclusion générale. Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la différenciation neuronale  Mise en évidence de l’impact de gradients locaux Redéfinition des monocouches auto-assemblées en qualité de substrat d’adhésion selon la distribution des énergies de surfaces qu’elles exposent  Classe 1 : très ordonnée Classe 2 : relativement (dés)ordonnée Classe 3 : très désordonnée Nécessité de combiner SFG et Owens – Wendt  Assignation des substrats élaborés aux classes définies Mise en évidence de l’influence des hétérogénéités chimiques locales du substrat dans les processus d’adhésion et de différenciation neuronale des cellules PC12 40

 Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+ Perspectives 41

Conclusion générale. Distribution de l’énergie de surface Distribution de l’énergie de surface ? 42