Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 integrase without cellular or viral cofactors Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. Grandgenett JOURNAL OF VIROLOGY Avril 2002

Différents types d’intégration  Intégrase Donneur ADN Receveur Intégration 1 LTR = Half-Site Integration (HSI) Intégration 2 LTR = Full-Site Integration Integration Concertée (FSI) CAGT ACTG GTCA TGAC CA OH ACTG GTCA HO AC 2(pGpT) CA OH ACTG GTCA HO AC 5’A C TG AC C A5’ CA GT TG AC CA GT Formation d’extrémités 5’ sortantes : Processing Transfert de brin NOYAU 3’5’ 3’ 5’ CYTOPLASME 3’ Génome de la cellule hôte ADN proviral

Duplications au niveau du génome de l’hôte duplication de quelques paires de bases Au niveau de l’ADN cellulaire, l’intégration du génome viral entraîne une duplication de quelques paires de bases de chaque coté de l’ADN viral. spécifique de chaque virus La taille de cette duplication est spécifique de chaque virus 6 pb pour les virus ALSV 5 pb pour HIV-1 5 pb pour HIV-1 (Asante-Appiah and Skalka, 1997)

Etat des connaissances 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs ADN 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs ADN  efficacité et fidélité très variables  efficacité et fidélité très variables  inefficacité de d’intégration concertée  inefficacité de d’intégration concertée  fidélité variable des duplications de 5 pb  fidélité variable des duplications de 5 pb Efficacité = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C  Grande variabilité des résultats  intervention de cofacteurs cellulaires ?  intervention de cofacteurs cellulaires ? rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires  efficacité FSI rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires  efficacité FSI rINT HIV-1: HMG-I(Y) et NC rINT HIV-1: HMG-I(Y) et NC  variation de l’activité de l’INT elle-même ?  variation de l’activité de l’INT elle-même ?  rINT HIV-1 in vitro inefficace seule pour FSI Fidélité # 70% Fidélité # 70%  Anomalies de repliement ?  Agrégation ?

Objectif de l’étude rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une intégration concertée efficace ? rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une intégration concertée efficace ? Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ? Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ? Stratégie Purification et utilisation INT recombinante purifiée à faible concentrations Purification et utilisation INT recombinante purifiée à faible concentrations  éviter l’agrégation  éviter l’agrégation  Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes GroEL-GroES chez des bactéries  éviter les anomalies de repliement de rINT  éviter les anomalies de repliement de rINT

Matériels et méthodes (1) Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb marqué 32 P marqué 32 P SupF SupF  sélection site restriction BglII unique Receveur plasmide pGEM3 rINT Clonée dans pET11a  expression dans cellules BL21(DE3) Protéines chaperonnes plasmide pGroESL également exprimé dans BL21(DE3)

Matériels et méthodes (2) Purification de rINT BL21(DE3) : pET11a +/- pGroESL Centrifugation Tampon + sonication surnageant culot + NaCl Lavages et centrifugations surnageant culot + NaCl 1M centrifugation surnageant INT 60% pureté Seph Hép 1 2 2’ INT >90% pureté + tampon standard (Mg ++ ) 3h + IPTG

Résultats (1) Expression rINT dans BL21(DE3) Expression rINT dans BL21(DE3) Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et GroEL Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et GroEL Stabilité des extraits INT /NaCl 1M Stabilité des extraits INT /NaCl 1M Lysat cellulaire T0Lysat cellulaire IPTG surnageants + chaperons

Résultats (2) Purification rINT et transfert de brin Purification rINT et transfert de brin  éviter agrégation rINT en solution : faible concentrations sur colonnes: utilisation totalité extrait NaCl 1M sur colonne 1 fractions les plus riches en INT  colonne 2 rINT purifiée à basse concentration reste active  HSI et FSI Résultats identiques avec/sans GroES GroEL Fractions 38 à chaperons, 20 min, 37°C

Résultats (3) Connaissances Zn++, Mg++ et détergents non ioniques perturbent l’association des sous-unités d’INT  perturbation activité Tampon standard contient Mg++ Tampon standard contient Mg++ Suppression Mg++ Suppression Mg++ ajout 10% glycérol ajout 10% glycérol  pureté identique  pureté identique  transfert de brin comparable  transfert de brin comparable Activité rINT indépendante de la présence de Zn++, Mg++ et glycérol dans les tampons Influence de la composition des tampons sur activité rINT ? Influence de la composition des tampons sur activité rINT ? 3-4: + chaperons, Seph x2 5-6: + chaperons, Hép-Seph 7-8: Hép-Seph

Résultats (4) Fidélité des duplications 5pb lors de l’intégration concertée Fidélité des duplications 5pb lors de l’intégration concertée U5 Utilisation préférentielle U5 pour intégration 70%sans chaperons Fidélité # 70% sans chaperons selon les études   par les protéines chaperons ?  séquençage de la zone d’insertion Présence de protéines chaperons n’augmente pas la fidélité des duplications 5 pb

Résultats (5) Comparaison qualitative des activités des rINT Comparaison qualitative des activités des rINT Action des protéines chaperons 3-7: 0 chaperons, gamme [rINt] 9-13: + chaperons, gamme [rINt] 9: reproductible  concentration seuil rINT nécessaire autre étude: chaperons améliorent très légèrement HSI -FSI Action de Zn++ Action de Zn++ Zn++ stimule la multimérisation des su d’INT et stimule légèrement HSI Légère  FSI

Résumé HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs in vitro HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs in vitro Modèle: Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent  sur ses facultés de polymérisation  sur ses facultés de polymérisation  sur l’efficacité de l’intégration concertée  sur l’efficacité de l’intégration concertéeLimites: Étude in vitro: intervention d’autres protéines chaperons in vivo ? Perspectives: Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à l’association en tétramères Détergents non ioniques + Zn++ + +