Au laboratoire de Pellegrin Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel Au laboratoire de Pellegrin

M. pneumoniae with respiratory epithelial cells

Infections respiratoires à M. pneumoniae ● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie) ● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes ● Transmission aérienne ● Enfant > 5ans, adulte jeune Trachéobronchites +++ Pharyngites - Pneumopathies atypiques - Asymptomatique (20%) ● Mode endémique avec poussées épidémiques Tous les 4-7 ans Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte

Manifestations extra-respiratoires  Non spécifiques ● Lésions cutanées +++ éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson ● Atteintes neurologiques encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré ● Arhrites, arthralgies ● Cardiaques (rares) myocardites, péricardites ● Anémie hémolytiques (rares)

Diagnostic biologique ● Recherche directe de la bactérie - Culture - PCR ● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

Prélèvements pour détection directe ● Mêmes pour culture et PCR ● Respiratoires pvt gorge (infection diffuse) asp. naso-pharyngée (jeune enfant) LBA (formes sévères) expectorations peu adaptées Autres (rares) ● Milieu de transport - Milieu 2SP (saccharose-phosphate) - conservation +4°C  24 h, puis -70°C

Culture de M. pneumoniae Fastidieuse, longue Exigence nutritionnelles  milieux spéciaux enrichis Hayflick modifié, SP4 (20% sérum, extrait levure, -lactamines) Solide ou liquide Glucose  37°C +/- CO2 pendant 2-3 semaines Prop. métaboliques en milieu liquide Fermentation glucose  Changement de couleur du rouge de phénol Dilutions indispensables (inhibiteurs)

Détection de la croissance en milieu solide ● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO2) Loupe binoculaire, 50-300µm 2-3 sem ● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR

Détection de la croissance en milieu liquide ● Virage indicateur coloré - Fermentation du glucose  acidification : virage du rouge de phénol : rouge  jaune - 2-3 semaines en primo-isolement  M. pneumoniae ● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100%  rare (labo spécialisés)

Détection par biologie moléculaire ● Hybridation par sonde : peu sensible ● 1ère publication de PCR en 1989 (Bernet, JCM, 89)  1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03) ● Cibles variées ATPase, gène tuf ARNr 16S adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité) ● Techniques variées - ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel - ARN : NASBA, RT-PCR 1 pCR multiplex récemment commercialisée

Détection par biologie moléculaire (2) ● Extraction d’ADN - phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN +/- SDS, protéinase K - sonication - ébullition - kits commercialisés - Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic)  Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100% L’extraction phénol-chloro diminuerait la sensibilité d’un facteur 10 par rapport à une protéinase K seule Selon la cible, selon la technique utilisée, la sensibilité …

Détection par biologie moléculaire (3) Avantages Rapidité Grande spécificité Bonne sensibilité si infection Quantification possible Typage des souches, (groupe 1 et 2) Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex) Limites Méthodes "maison" Contrôles indispensables - Négatifs - Internes - Extraction Présence possible comme commensal? Détection d’organismes non viables Controles négatifs (recherche contaminants) Controles internes (Vérification absence d’inhibiteurs, fréquents) Controle d’extraction

Diagnostic biologique ● Recherche directe de la bactérie - Culture - PCR ● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

Diagnostic indirect sérologique Très utilisé mais résultat tardif Cinétique des AC IgM : 1 sem après début infection, enfants +++ IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs mois IgA ? Différentes techniques - agglutination de particules - immunofluorescence - Fixation du complément - ELISA (différents antigènes)

Cinétique des anticorps IgG Quantité d'Anticorps IgM Temps (semaines) Infection

En résumé Diagnostic par PCR + sérologie Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue)  degré maximal de certitude  diagnostic en 1 ou 2 jours Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums

Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae Prélèvement de gorge Extraction d'ADN automatisée MagNAPure PCR en temps réel Taqman Prism 7000 Interprétation des résultats

Extraction d'ADN automatisée MagNA Pure LC, Roche diagnostics Principe - Lyse cellulaire et dénaturation des protéines - Digestion des protéines (Protéinase K) - Liaison de l'ADN à la surface de particules de verre magnétiques - Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…) - Elution de l'ADN purifié à haute température La protéinase K est une protéase végétale très active, même en présence de laurylsulfate (SDS) ou d'EDTA, et qui n'a aucun effet d'hydrolyse sur les acides nucléiques. Elle hydrolyse les protéines de toutes origines en quelques heures avec une préférence pour les liaisons peptidiques situées après les acides aminés hydrophobes (leucine, par exemple). La protéinase K est utilisée dans les techniques de préparation et de purification des acides nucléique

Amplification par PCR temps réel ABI Prism 7000 PCR en temps réel - Protocole Taqman - Cible : Adhésine P1 2 amorces : P1-204 P1-328 1 sonde de 125 bp P1-284R (FAM-TAMRA)

Sondes Taqman - Principe Hybridation d'une sonde spécifique Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein ● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine  pas d'émission de fluorescence Qd il est stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le ppe FRET qui dissipe l'énergie sous forme de chaleur. Comme l'activité 5'exonucléasique de la Taq est sp de l'ADN double brin, les sondes libres en solution demeurent intactes et aucune fluo n'est émise Lors de l'élongation, la Taq déplace la sonde et l'hydrolyse. Le reporter est alors libère de l'environnement suppresseur permettant ainsi l'émission de fluorescence qui augmente à chaque cycle proportionnellement aux taux d'hydrolyse de la sonde Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

Sondes Taqman - Principe Cette méthode repose sur deux principes : - la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol Reporter Quencher FP 3’ 5’ FAM, VIC TAMRA La fluorescence émise par le reporter est absorbée par le quencher 5’ 3’ RP  Spécificité l’amorce pour la PCR  Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

Sondes Taqman - Principe Lumière FP R Q 3’ 5’ 5’ 3’ RP - FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

R FP Q 3’ 5’ 5’ 3’ RP - au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde  libération du reporter R Q FP 3’ 5’ 5’ 3’ RP - lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

Sondes Taqman Avantage : - Spécificité accrue Spécificité des primers pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents Inconvénient : - Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

Protocole opératoire - Extraits dilués au 1/10ème - Préparation du Mix Amorces Sondes Mix (dNTP, Taq Polymérse, tampon) + Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème - Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn  permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon - Amplification d'une gamme de concentration Culture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème - Protocole du thermocycleur 10min 95°C 15 sec à 95°C 1 min à 60°C 40 cycles

Interprétation 10-3 10-1 10-2 pur Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème

Patient En rouge : patient positif pour M. pneumoniae

Conclusion Y a-t-il infection par M. pneumoniae ? PCR positive : oui, très certainement PCR négative : ne permet pas d'éliminer le diagnostic  A confronter avec le résultat de la culture et des sérologies