Bioingénierie de l’A.D.N. Semaine du 21 Septembre 2009 Outils du génie génétique 3. PCR CHMI 3216F – A2009
PCR Outil très puissant Permet le synthèse in-vitro d’une molécule d’A.D.N. spécifique à partir de très faibles quantités. 3 étapes de base (1 cycle de PCR): Dénaturation de l’A.D.N. Hybridation d’amorces Synthèse d’un brin complémentaire par l’ A.D.N. polymérase CHMI 3216F – A2009
PCR L’augmentation dans la quantité d’ A.D.N. ainsi obtenue est exponentielle: double à chaque cycle (en théorie…..) L’augmentation de la quantité d’ A.D.N. suit la règle suivante: Augmentation = 2n n = nombre de cycles Donc, 25 cycles d’amplification par PCR permet d’obtenir, en théorie, une augmentation de la quantité d’ A.D.N. de 34 million de fois!!! En réalité, une augmentation de 2 fois par cycle est rarement obtenue, principalement à cause de facteurs limitant tels: La présence d’inhibiteurs Des régions riches en GC dans l’ A.D.N. gabarit. CHMI 3216F – A2009
PCR CHMI 3216F – A2009
PCR – Réactifs CHMI 3216F – A2009
Sélection des amorces CHMI 3216F – A2009
PCR CHMI 3216F – A2009
PCR CHMI 3216F – A2009
PCR Amorce 5’: 5’atg gac ggg tcc ggg gag cag ccc 3’ – BRIN CODANT 5’atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccca3’ 3’tacctgcccaggcccctcgtcgggtctccgccccccgggt5’ 95oC, 1 min 5’atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccca3’ 5’atggacgggtccggggagcagccc 3’ 3’tacctgcccaggcccctcgtcgggtctccgccccccgggt5’ CHMI 3216F – A2009
PCR CHMI 3216F – A2009
Amorce 3’: 5’acc atc tgg aag aag atg ggc tga3’ BRIN CODANT 3’tgg tag acc ttc ttc tac ccg act5’ BRIN NON-CODANT 5’ tca gcc cat ctt ctt cca gat ggt 3’ 5’ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctga3’ 3’gagtggcggagcgagtggtagaccttcttctacccgact5’ 95oC, 1 min 3’tggtagaccttcttctacccgact5’ 5’ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctga3’ 3’gagtggcggagcgagtggtagaccttcttctacccgact5’ CHMI 3216F – A2009
PCR CHMI 3216F – A2009
PCR Propriétés importantes des amorces: Longueur: 20-24 nt; Point de fusion (Tm) = 50-70oC Tm= 2(A+T) +4(G+C) T hybridation = Tm-4oC %GC: 35%-65%; Bout 3’ riche en GC (agit comme point d’ancrage); Pas de séquences complémentaires entre deux amorces ou au sein d’une même amorce; Pas de pairage (même mineur) avec d’autres séquences d’A.D.N. non-reliés à l’ A.D.N. d’intérêt (vérification de la spécificité des amorces par Blast). http://www.microbiology.adelaide.edu.au/learn/oligcalc.htm CHMI 3216F – A2009
PCR-Température d’hybridation 55oC 50oC 1 2 3 Primer sets M 603 bp 310 bp 281 bp 234 bp 194 bp 118 bp CHMI 3216F – A2009
PCR – Fidélité de l’amplification Amplification sans l’introduction de mutations dans la séquence d’A.D.N. synthétisé; Absence d’amplification de séquences homologues (apparentées) à la séquence cible. CHMI 3216F – A2009
PCR-amorces CHMI 3216F – A2009
PCR-nombre de cycles Quoique le rendement en produit amplifié augmente avec le nombre de cycles, on aura aussi en même temps la possibilité de: Amplification de séquences homologues; Introduction de mutations dans l’A.D.N. amplifié. CHMI 3216F – A2009
PCR-Effet du Mg+2 Mg2+ est un co-facteur pour toutes des A.D.N. polymérases Cependant, n’oublions pas que: Les amorces et les dNTPs lient le Mg2+ Trop de Mg2+ favorisera l’appariement non-spécifique des amorces; Donc: une concentration optimale de Mg2+ doit être établie pour chaque paire d’amorce. CHMI 3216F – A2009
PCR-Effet du Mg+2 Stoffel fragment: moins sensible à la chaleur et pas d’activité 5’3’ exonuclease. CHMI 3216F – A2009
PCR-Effet du Mg+2 CHMI 3216F – A2009 http://www.promega.com/guides/pcr_guide/070_04/promega.html CHMI 3216F – A2009
PCR-Effet du Mg+2 http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p14.html CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. polymérases Processivité: nombre de nucléotides polymérisés avant que l’A.D.N. pol ne quitte la molécule dA.D.N. cible. Fidélité: précision de l’enzyme (e.g. enzyme très fidèle: peu ou pas de mutations introduites dans l’A.D.N. amplifié). CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. polymérases CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. polymérases IMPORTANT: Fidélité et rendement sont mutuellement exclusifs! CHMI 3216F – A2009
PCR- Effet plateau CHMI 3216F – A2009 http://www.biotechlab.northwestern.edu/pe/sld021.htm CHMI 3216F – A2009
PCR- Effet plateau CHMI 3216F – A2009 http://www.biotechlab.northwestern.edu/pe/sld021.htm CHMI 3216F – A2009
PCR- Effet plateau Effet plateau – diminution du taux d’accumulation (en théorie exponentiel) du produit de PCR. Peut être causé par: L ’épuisement des dNTPs L’épuisement des amorces Diminution de la stabilité des réactifs (p.ex. activité enzymatique; particulièrement à la température de dénaturation) Inhibition de la réaction par l’accumulation d’A.D.N. double brin; Compétition non-spécifique pour les réactifs (p.ex. lors de l’amplification non-spécifique d’A.D.N. homologue au brin cible) Hybridation des produits d’amplification l’un avec l’autre au lieu d’avec les amorces (particulièrement problématique lorsque la concentration en amplicon atteint des nivaux élevés). CHMI 3216F – A2009
Principal problème du PCR: la spécificité CHMI 3216F – A2009
Augmenter la spécificité d’amplification Méthode “Hot Start” http://www.biotechlab.northwestern.edu/pe/sld021.htm CHMI 3216F – A2009
PCR-Spécificité CHMI 3216F – A2009
Augmenter la spécificité d’amplification Utilisation d’amorces “internes” (nested primers) Utiliser deux paires d’amorces pour amplifier un fragment d’intérêt: La première paire d’amorce est utilisée pour obtenir un fragment plus grand de l’A.D.N. d’intérêt; Une seconde paire d’amorce, choisie à l’intérieur du premier fragment amplifié, est utilsée dans une seconde amplification par PCR. CHMI 3216F – A2009
Augmenter la spécificité du PCR Touchdown PCR Dans le touchdown PCR, la réaction est tout d’abord faite à une température d’hybridation plus élevée de quelques degrés (p.ex. 5oC) de la température d’hybridation optimale des amorces; Pendant les premiers cycles, la température d’hybridation est progressivement diminuée (1oC par cycle); Le but est de favoriser l’amplification de l’A.D.N. d’intérêt pendant les tous premiers cycles, limitant l’amplification de produits non-spécifiques lors de cycles subséquents. CHMI 3216F – A2009
PCR- A.D.N. riche en GC Betaine + - CHMI 3216F – A2009
PCR vs clonage CHMI 3216F – A2009
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Devoir #4! CHMI 3216F – A2009