Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lipoproteins Hua Huang*, Fang Sun*, David M. Owen ₣, Weiping Li‡, Yan Chen*, Michael Gale Jr. ₣, and Jin Ye*§ Departments of *Molecular Genetics, ₣Microbiology, and ‡Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390-9046

Introduction Le virus HCV Virus à ssRNA (+) Sécrété en abondance uniquement par hépatocytes Facteurs de spécificité tissulaire ? Une partie du virus circule lié aux VLDL

Complexe de réplication Réplication virale a lieu dans une ultrastructure associée à la membrane : « membranous web » Visualisé sur HuH7 contenant un réplicon de HCV 1b Uniquement protéine NS Réplication sans production de particules infectieuses Nature et composition des «membranous web» non étudiée

Synthèse des VLDL Particules sphérique de 30 à 80nm Rôle d’export tissulaire des TG Composition des VLDL Protéine de structure : apoB-100 et apoE Chargement de TG via MTP dans ER + Golgi 56% TG 19% PL 12% EC

Purification des « membranous web » Ligné HuH7 – 5A-GFP-6 NS5A taggé GFP en COOH terminal Isolation immunomagnétique des vésicules par des billes Dynabeads coatées par anti-GFP Homogénéisation des cultures cellulaires Séparation et récupération des vésicules liées et non liées

Contenu en protéines virales des « membranous web » SDS/PAGE + Immunoblot Env 50% NS5A dans vésicules liées  50% des autres NSP Pas de contamination  10%

Contenu en HCV RNA des « membranous web » Signal uniquement dans vésicules extraites par billes taggés qRT-PCR Vésicules purifiées enrichies en RNA viral et en protéines NS = COMPLEXE de REPLICATION

Caractérisation des protéines associées aux CdR des « membranous web » Vésicules attachées solubilisées  Extrait analysé par SDS/PAGE Excision des bandes  Digestion trypsine Tandem MS > 30% des protéines identifiées impliquées dans métabolisme lipidique Dont MTP et ApoE

Confirmation de la présence d’ApoB, ApoE et MTP dans les vésicules Données bibliographiques Cliniquement : association dans le plasma VLDL - HCV ApoB-100 non retrouvé Masse moléculaire élevée (540 kDa) Hydrophobicité globale Confirmation de la présence d’ApoB, ApoE et MTP dans les vésicules 50% de MTP 30% d’ApoE 50% d’ApoB

Colocalisation par immunofluorescence Colocalisation ponctiforme de NS5A et ApoB  Vésicules contenant NS5A et ApoB

Origine des vésicules : ER ou Golgi ? Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis traitées : Endoglycosidase H : hydrolyse liaison N-sucres des protéines de l’ER Peptide N-glycosidase F : hydrolyses toutes les liaison N-sucres ApoB sécrétée insensibles à Endo H Sensible à Endo H Vésicules contenant le CdR dérivent de l’ER

Sécrétion des VLDL et réplication HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038) Inhibition chargement VLDL provoque ubiquitinilation ApoB Cellules lavées avant incubation avec inhibiteur : éviter contamination de ApoB sécrétée Sécrétion des VLDL non nécessaire à la réplication virale

Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieuses Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, produisant constitutivement du virus infectieux Incubation +/- MTP Diminution HCV dans le milieu n’est pas du à une diminution de synthèse

Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieuses Souche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contre ApoB GFP Immunoblot sur le surnageant de culture

Inhibition importante mais moins efficace que MTP Diminution de 50% Inhibition importante mais moins efficace que MTP Diminution de 70%

Discussion Purification vésicules caractéristiques de complexe de réplication du HCV Ces données + données cliniques suggères que les particules de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des lipoparticules Test d’inhibition au MTP : sécrétion résiduelle de virus (20%) Voie VLDL-indépendante ? Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ? Dans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicrons Pas de sécrétion de HCV par l’intestion Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables de la spécifité tissulaire ?

Discussion Production virale continuelle nécessaire à maintient du virus Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL pourrait être efficace siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et le primate RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en essais clinique chez l’homme dans les dyslipidémies Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, avec accumulation de graisse hépatique faible et réversible Test des inhibiteurs de la MTP en traitement à court terme de l’infection à HCV