LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC) 6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC) Méthodes de détection disponibles Dr. Estelle LOUKIADIS Laboratoire d’étude des microorganismes alimentaires pathogènes (LMAP)/ LNR STEC UR CALITYSS Equipe Ecologie microbienne et sécurité sanitaire des aliments

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Tous les STEC ne sont pas tous pathogènes !! Enfin, pour compléter ce schéma représentant la physiopathologie des infections dues aux EHEC, il convient de rappeler que l’homme se contamine par ingestion de souches EHEC.

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Complexité génétique des STEC Enfin, pour compléter ce schéma représentant la physiopathologie des infections dues aux EHEC, il convient de rappeler que l’homme se contamine par ingestion de souches EHEC.

En terme de santé publique, comment définir une souche STEC pathogène? 6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 E. coli potentiellement pathogènes stx + and eae + E. coli Caractéristiques phénotypiques et génotypiques E. coli pathogènes En terme de santé publique, comment définir une souche STEC pathogène?

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Définition des souches STEC considérées comme pathogènes Avis AFSSA du 15 juillet 2008 précisé dans l’avis AFSSA du 27 mai 2010

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 EAEC = isolés chez les malades 2011: STEC O104:H4 épidémique? Escherichia coli STEC (gènes stx) EHEC = STEC isolé des malades AEEC (gène eae) ! E. coli O157, O26, O103, O111 et O145 EHEC typiques majeures

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Dans les aliments • des E. coli O157: NF EN ISO 16654:2001 et méthodes alternatives Prise d’essai :25 g Enrichissement à 41,5°C Billes magnétiques recouvertes d’Ac anti-O157 Milieu CT-SMAC ne dégrade ni le sorbitol, ni le rhamnose n’excrète pas de β-glucuronidase Résistance au céfixime et au tellurite

?? Détection des STEC non-O157 VTEC dans les aliments? 6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Détection des STEC non-O157 VTEC dans les aliments? Pas de caractéristique biochimique commune pour les distinguer des autres E. coli ! ??

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Dans les aliments • des STEC O26, O103, O111, O145 et O157: ISO TS 13136 TS ISO 13136 Publication en 2012

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6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 ISO TS 13136 Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et O145 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Dilution au 1/10ème 18-24h 37°C Détection des gènes stx et eae par RT-PCR DEPISTAGE Echantillons négatifs en 26h Si stx+ et eae+ Si un des 5 marqueurs somatiques + Echantillons suspects en 30h CONFIRMATION Echantillons confirmés en 48h

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Complexité de la détection des STEC La présence des gènes stx ne signifie pas systématiquement qu’il y ait une souche STEC dans l’échantillon (valeur prédictive positive dans les aliments faible voire nulle) La présence du gène eae en combinaison avec les gènes stx est importante mais non suffisante = les marqueurs somatiques doivent être recherchés

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Complexité de la détection des STEC Screening PCR de plusieurs marqueurs = Les différents marqueurs recherchés (virulence/sérogroupes) peuvent être présents dans des bactéries différentes et il existe des phages Stx à l’état libre dans les aliments La confirmation par isolement est nécessaire pour démontrer que tous les marqueurs détectés sont associés à une seule et même souche d’E. coli viable.

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 ISO TS 13136 Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et O145 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Dilution au 1/10ème 18-24h 37°C Détection des gènes stx et eae par RT-PCR DEPISTAGE Echantillons négatifs en 26h Si stx+ et eae+ Si un des 5 marqueurs somatiques + Echantillons suspects en 30h CONFIRMATION Echantillons confirmés en 48h

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Exemple: Taille de la prise d’essai Classiquement 25 g Augmentation de la taille de la prise d’essai?

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Etude de plusieurs paramètres: t°, durée, nature du milieu , nature et concentration en antibiotiques, effet matrice Inoculation expérimentale de matrices (> cultures pures!) Etude de plusieurs souches STEC différentes (effet sérogroupe, effet souches) Exemple: Enrichissement des STEC O26 dans les fromages au lait cru

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence Avis afssa 2008: critères génétiques principaux EHEC EHEC O157:H7/H- rfbE-O157 fliC-H7 stx1 et/ou stx2 eae γ1 (OI-122)* EHEC O26:H11/H- wzx-O26 fliC-H11 stx1 et/ou stx2 eae β (OI-122)* EHEC O103:H2/H- wzx-O103 fliC-H2 stx1 et/ou stx2 eae ε (OI-122)* EHEC O111:H8/H- wbdI-O111 fliC-H8 stx1 et/ou stx2 eae θ (OI-122)* EHEC O145:H28/H- ihp1-O145 fliC-H28 stx1 et/ou stx2 eae γ1 (OI-122)* Développement d’outils PCR en temps réel multiplex Madic et al. JAM 2010. 109:1696-1705. Madic et al. AEM 2011. 77:2035-2041. Mazuy-Cruchaudet et al. Zoonoses and Public Health 2012

in fresh minced beef in France: Prevalence of the 7 major serogroups of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) in fresh minced beef in France: A novel real-time PCR strategy for their early detection in food C.Mazuy-Cruchaudet1, C. Bavai1, P. Fach2, E. Loukiadis1 1- Lyon University, VetAgro Sup, LMAP, French National Reference Laboratory for E. coli, FRANCE 2- French Food Safety Agency (ANSES)-Laboratoire de Sécurité des aliments, FRANCE  

Results and discussion Markers/strains detected Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Top 5 screening N = 2476 samples (25g) Markers/strains detected Nb of positive samples stx+ eae+ 109 stx+ eae+ top 5+ 79 EHEC strains isolated (top 5) 6 ISO TS 13136 4,4% 3,2% 0,2%

Results and discussion Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Top 5 screening N = 2476 samples (25g) Markers/strains detected Nb of positive samples stx+ eae+ 109 stx+ eae+ top 5+ 79 EHEC strains isolated (top 5) 6 ISO TS 13136 4,4% GD1 3,2% GD2 0,2% Markers/strains detected Nb of positive samples stx+ eae+ 109 stx+ eae+ nleB+ 88 stx+ eae+ nleB+ top 5+ 67 stx+ eae+ nleB+ top 5/eae assoc.+ 29 EHEC strains isolated (top 5) 6 New approach 4,4% 3,6% 2,7% 1,2% 0,2%

Results and discussion Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Top 7 screening N = 2476 samples (25g) Markers/strains detected Nb of positive samples stx+ eae+ 109 stx+ eae+ top 7+ 84 EHEC strains isolated (top 7 ) 7 ISO TS 13136 MLG 5B 4,4% GD1 3,4% GD2 ! Variation with serotype 0,3% Markers/strains detected Nb of positive samples stx+ eae+ 109 stx+ eae+ nleB+ 88 stx+ eae+ nleB+ top 7+ 71 stx+ eae+ nleB+ top 7/eae assoc.+ 29 EHEC strains isolated (top 7) 7 New approach 4,4% 3,6% 2,9% 1,2% 0,3%

Results and discussion Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Top 5 contamination rate: 6/2476 (0,2 % CI95 [0,09%- 0,5%]) • Low contamination rate • In accordance with previous results observed in France Year Type of minced beef Top 5 rate 2007 Frozen (production) 0,3% (11/3605) CI95 [0,2 – 0,5%] 2008 Frozen trims (production) 0,4% (15/4000) CI95 [0,2 – 0,6%] 2009 Fresh (at retail) 0,1% (2/1527) CI95 [0,04 – 0,5%] Top 7 contamination rate: 7/2476 (0,3 % CI95 [0,1%- 0,6%]) • First data in French minced beef • Low contamination rate (comparison with other areas? USA: 0,2% CI95 [0,05 – 0,3%] (6/4133) (Bosilevac and Koohmaraie, 2011))

Results and discussion Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Characteristics of the 7 EHEC strains isolated Serotype stx genes eae variants OI 122 marker Nb of strains isolated EHEC O157:[H7] stx2 eae γ nleB 1 EHEC O26:[H11] stx1 eae β 4 EHEC O103:H2/H¯ stx1 or stx2 eae ε EHEC O111:H8/H¯ eae θ EHEC O145:[H28] EHEC O121:H19/H¯ EHEC O45:[H2] Only 1 EHEC O157:H7 and a majority of EHEC O26:H11 (4/7) Top 5 Top 7 No EHEC O103, O111 nor O121

Conclusion Prevalence of major EHEC in fresh minced meat in France Introduction Objectives Materials and methods Results and discussion Conclusion Prevalence of major EHEC in fresh minced meat in France The 5 and the 7 major EHEC serogroups (top 5 and top 7) were detected at a low rate (0,2% and 0,3% respectively) O26 was the main isolated EHEC serogroup in meat None O111 nor O121 strains were isolated A novel real-time PCR strategy for EHEC detection in food using OI122 marker and association of serotype with specific eae variants A complementary approach to the ISO TS 13136 A reliable strategy (specific and sensitive) A cost effective screening (reduce the number of PCR suspicions without increasing time analysis)

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC Possé et al., 2008

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Exemple: Facteurs biotiques et abiotiques influençant la croissance et la survie de STEC  Caractérisation de l’impact sur la croissance  Quelles voies métaboliques sont en jeu ? M. Cornu et al., Food Microbiology 28 (2011) 639e647  Pourquoi y a-t-il une sélection des bactéries dans les matrices alimentaires?  Transfert à l’optimisation des méthodes de détection (géloses) Prigent-Combaret et al. 2012

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement  Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC

6ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012 Conclusion: ISO TS 13136 La première méthode de référence pour la recherche des STEC dans les aliments (comparaison des résultats possibles) Méthode robuste (EILA UE et France) Méthode compatible avec une accréditation ISO 17025 Optimisations méthodologiques nécessaires ! Sérotypes de STEC pathogènes non détectés (ex O104:H4 eae-)…mais modularités et flexibilité de la méthode.

Le LNR STEC Une équipe de 15 personnes

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