EXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATION Mémoire présenté par Amine GHOZLANE EXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATION Responsable de stage : Jacques BOURBON, Directeur de recherche Equipe « Pathologie des épithéliums respiratoires et du développement pulmonaire » Stage réalisé dans le Laboratoire INSERM Unité 651, Faculté de Médecine : 8, Rue du Général Sarrail, 94010 Créteil Cedex

Introduction Alvéolisation : Dernière phase du développement pulmonaire Aboutit à la formation d’un poumon mature et complètement fonctionnel Alvéolisation Humain 36 semaines Naissance 2 ans Alvéolisation Rat 4 jours 14 jours Anténatal Postnatal

Peu de gènes impliqués identifiés Modifications structurales dans les régions distales du poumon pendant l’alvéolisation Avant l’alvéolisation (stade sacculaire) : Après l’alvéolisation : Canal alvéolaire Septa primaire Sacs alvéolaires Peu de gènes impliqués identifiés Analyse systématique des gènes modulés pendant l’alvéolisation (Puces à ADN) 4. Pneumocyte de type I 5. Pneumocyte de type II 6. Capillaire Canal alvéolaire Septa secondaire Alvéole 4. Pneumocyte de type I 5. Pneumocyte de type II 6. Capillaire source : http://www.snv.jussieu.fr/bmediahomeotiqueindex.html

augmentée pendant l’alvéolisation Données des puces ADN Affymetrix : Gènes dont l’expression est fortement augmentée pendant l’alvéolisation 7 J/ 2 J 21 J/ 7 J Gènes Midkine (Mdk) Homeobox A2 (Hoxa2) Drosophila polarity gene (frizzled) homologue (Fzd1) Eph receptor B2 (Ephb2) Retinol-binding protein (Rbp1) Retinoid X receptor gamma (Rxrg) Integrin, alpha 1 (Itga1) Drebrin 1 (Dbn1) Shab-related delayed-rectifier K+ channel (Kv9.3) Homeobox A4 (Hoxa4) Fibulin 5 (Fbln5) Mesenchyme homeobox 2 (Meox2) Timeless (Drosophila) homolog (Timeless) Latent transforming growth factor beta binding protein 2 (Ltbp2) Fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3) Homeobox A5 (Hoxa5) Platelet-derived growth factor receptor alpha (Pdgfra) Fibrillin-1 (Fbn1) Fibrillin-2 (Fbn2) Lysyl_oxidase_(Lox) Fibronectin 1 Chondroitin sulfate proteoglycan 2 (versican) Agrin Glypican 3 (Gpc3) Fibroblast growth factor 10 (Fgf10) Slit (Drosophila) homolog 3 (Slit3) Endothelial differentiation sphingolipid G-protein-coupled receptor 1 Pleiotrophin (Ptn) Hoxa2 Hoxa4 Hoxa5 Rat Naissance 4 jours 14 jours Alvéolisation Fold-change ratio 0 0.5 1 2 3 4 >5

Les gènes Hox : facteurs de transcription à homéodomaine impliqués dans l’organogenèse inactivation Hoxa5 = défaut d’alvéolisation (Kinkead et al. 2004) pas d’autres données sur les Hox dans l’alvéolisation Implication des gènes Hox dans les mécanismes de contrôle de l’alvéolisation ?

Les gènes Hox sont effectivement plus exprimés pendant l’alvéolisation Confirmation des variations de l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 par une méthode plus précise : la PCR en temps réel 50 100 150 200 250 300 350 2 jpp 7 jpp 21 jpp Hoxa5 * 50 100 150 200 250 300 350 400 2 jpp 7 jpp 21 jpp Hoxa2 * 50 100 150 200 250 300 350 400 2 jpp 7 jpp 21 jpp Hoxa4 * Les gènes Hox sont effectivement plus exprimés pendant l’alvéolisation dans les fibroblastes. Les variations sont-elles spécifiques de la période de l’alvéolisation ?

pendant l’alvéolisation. Profil temporel d’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4, Hoxa5 dans le poumon de rat depuis la période fœtale (stade canaliculaire) jusqu’à l’âge adulte (% de F18) Alvéolisation 50 100 150 200 250 300 F18 F19 F21 J1 J3 J5 J8 J14 J20 Adulte Hoxa2 Hoxa4 Hoxa5 naissance jours Augmentation de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier seulement pendant l’alvéolisation. Y a-t-il modification de l’expression de ces gènes lors de l’altération du développement alvéolaire ?

Modèles expérimentaux d’altération du développement alvéolaire Hyperoxie : FiO2 à 95% Administration d’un glucocorticoïde : Hyperoxie (FiO2 = 95%) 100 µm Air (FiO2 = 21%) 100 µm Diluent Témoin Dex 0.1 µg/g/j Dexamethasone (0,1µg/g/j pendant 5 jours).

Effets de l’exposition du rat nouveau-né à l’hyperoxie (FiO2>95%) sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5. 20 40 60 80 100 120 140 Hoxa2 air O2 NS * 4jpp 7jpp air O2 20 40 60 80 100 120 140 Hoxa4 * 4jpp 7jpp 20 40 60 80 100 120 air O2 Hoxa5 * 4jpp 7jpp Diminution de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier sous hyperoxie.

Diminution de l’expression des Hox dans le poumon entier après Effets de l’administration répétée de dexamethasone (dex) 0,1µg/g ou 0,5µg/g par jour sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 chez le rat nouveau-né. Témoin Dex 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j Hoxa2 20 40 60 80 100 120 * * Hoxa4 Témoin Dex 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j 20 40 60 80 100 120 * 20 40 60 80 100 120 Témoin Dex 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j Hoxa5 * * * Diminution de l’expression des Hox dans le poumon entier après administration de dexamethasone.

Effets in vitro de la dex sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans des fibroblastes isolés du poumon de rats nouveau-nés. 20 40 60 80 100 120 140 Témoin Hoxa4 dex 10-6 M 20 40 60 80 100 120 140 Témoin Hoxa5 dex 10-6 M Pas d’effet de la dexamethasone sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans les fibroblastes en culture.

Conclusion L’expression des 3 gènes Hox : est augmentée pendant l’alvéolisation est diminuée lors de l’altération de l’alvéolisation suit un profil identique Ces résultats sont en faveur d’un rôle positif de ces gènes dans le mécanisme de contrôle de l’alvéolisation

Bilan du stage Techniques pratiquées: Isolement et culture primaire de fibroblastes Extraction des ARN RT- PCR temps réel Aborder et exposer une problématique scientifique Implication physiopathologique