XChIP Bilan technique – 12 mars 2010

in vivo foot-printing versus ChIP  in vivo foot-printing: résolution élevée (1 bp) mais protéine non identifiée  ChIP: résolution plus faible (≤1 kbp) mais protéine identifiée

Fixation  UV: cross-linking ADN/protéines uniquement en contact direct  Formaldéhyde: réagit avec les amines primaires des acides aminés ou des bases de l'ADN ou l'ARN; liaison covalente réversible entre 2 amines primaires proches (≤2 Å)

Cross-linking  faire varier la durée du cross-linking, la concentration de formaldéhyde, la température  ex de conditions standard: 1% formaldéhyde, 10 minutes, 12°C à 37°C  pour les histones, la durée du cross- link peut être réduite (  Native ChIP)

Cross-linking

Lyse des cellules  lyse efficace ~ meilleure reproductibilité des résultats  peut être suivie au µscope  un indicateur: la concentration en ADN de l'extrait

Sonication  facteur critique pour une bonne résolution  essentiel pour obtenir de la chromatine soluble  500 bp i.e. plus de 90% de l'ADN est entre 100 et 1000 bp  alternative: nucléase de microcoque

Immunoprécipitation  l'anticorps doit être en excès  quantité d'anticorps à déterminer par immunoprécipitation sur des extraits de cellules non fixées: quantité d'anticorps qui déplète au moins 90% de la protéine d'intérêt  après cross-linking, l'immunoprécipitation est moins efficace (~50%)

Choix des billes

Elution  à la chaleur  avec NaHCO3, SDS  par compétiteur: peptide spécifique dans le cas où l'anticorps est dirigé contre un peptide (plus spécifique, moins de bruit de fond, beaucoup plus cher)

Stratégie de PCR  choix des primers (Tm, GC, dimères, hairpins, BLAST)  semi-quantitative (BET < SYBR green < [ 32 P]dATP)  quantitative (SYBR green, Taqman)

Quantification  normalisation par rapport à un gène contrôle (-actine, GAPDH etc..)  normalisation par rapport à un calibrateur (MLL-/-) (biais !!!)  méthode de choix: expression des résultats en % de l'Input

Contrôles  mock IP (anticorps "irrelevant", pas d'anticorps, serum)  régions génomiques ne fixant pas la protéine  mutation du site de liaison de la protéine  utilisation de lignées mutantes ...

Bonnes IP !!!