Cours d'Hémato-cytologie DUT ABB 3- Frottis sanguins Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

LE FROTTIS SANGUIN obtenir sur une lame de verre une couche unicellulaire d'éléments figurés du sang répartis sur tout le frottis et fixés dans l'aspect le plus proche de leur état physiologique

Appliquer un mouvement de translation horizontale rapide en maintenant la spatule d’un angle de 45° environ sans appuyer tout au long de la lame. Sécher par agitation pour fixer temporairement les cellules Positionner la lame de façon à prendre la totalité de la goutte. La laisser se répartir de façon homogène le long du biseau.

Bon frottis:   de bonne taille (½ à ¾ de la lame) de bonne densité, goutte étalée en entier, distant des bords de la lame donc accessible en tout point à l’observation microscopique Ce qu’il ne faut pas faire

Coloration Frottis sanguin: May Grünwald Giemsa L'action des ions acides et basiques obtenus après dissociation par de l'eau neutre de deux colorants alcooliques (méthanoliques) -le May Grünwald (éosine – bleu de méthylène) -le Giemsa (éosine – azur de méthylène) sur les éléments cellulaires complémentaires permet d'obtenir quatre affinités : - trois orthochromatiques Acidophile: du gris au légèrement rosé Basophile: violet foncé au noir Neutrophile: rose-violet - une métachromatique Azurophile: rose-rouge

Technique: Eau neutre :eau dé ionisée (acide) neutralisée par quelques gouttes d’eau du robinet (basique) en présence d’un indicateur coloré virant aux alentours de 7,4 (par exemple : le Bleu de Bromothymol). Plus rapide et suffit parfois eau du robinet ou comprimés eau neutre Fixer le frottis par le méthanol en l’immergeant dans le May Grünwald pur pendant 3 minutes. Plonger la lame dans un bain de May Grünwald dilué au ½ en eau neutre durant une minute. Plonger la lame dans un bain de Giemsa dilué au 1/10ième durant 20 minutes (Giemsa lent). Rincer doucement la lame à l’eau neutre ou du robinet. Essuyer le dessous de la lame. La laisser sécher verticalement.

L’examen du frottis sanguin faible grossissement (obj.x40) permet d’apprécier la qualité du frottis Études Cytologiques: obj.x100 à l’immersion. - observer les éventuelles anomalies morphologiques des GR: anomalies de forme, de taille, de coloration, la présence d’inclusions intra-érythrocytaires. -observer les éventuelles anomalies morphologiques des plaquettes (taille, forme), la présence éventuelle d’amas plaquettaire, et confirmer la densité de la numération plaquettaire. -Effectuer la Formule Leucocytaire -penser aussi aux Parasites sanguins intra éryhthrocytaires (Plasmodium, Babésia) ou extra-érythrocytaires (Trypanosomes, Microfilaires)

Parcours du frottis sanguin en vue de la réalisation d’une formule leucocytaire La formule leucocytaire correspond à la distribution des différentes variétés leucocytaires identifiées le long d’un parcours qui tient compte de la distribution des globules blancs lors de l’étalement (les granulocytes et les monocytes sont plus fréquemment rencontrés sur les bords et en bout de frottis). Cette distribution doit être représentative de la répartition physiologique des leucocytes. Identifier ainsi 100 (ou 200) leucocytes minimum et calculer le pourcentage des différentes variétés Calculer à l’aide de la numération des leucocytes les valeurs absolues indispensables à l’interprétation de la formule leucocytaire

Remarques : Des leucocytes immatures (ou anormaux) peuvent être identifiés lors du parcours. Exemple: myéloblastes, promyélocytes, myélocytes,…. ils sont à inclure dans le pourcentage et à introduire dans le % de la formule leucocytaire. Des érythroblastes  (souvent Erythroblastes acidophiles ou polychromatophiles) peuvent être également rencontrés ; Ils sont à compter au cours de la formule leucocytaire, mais ne sont pas inclure dans le % de la formule leucocytaire. Exemple de FL avec éléments immatures: Polynucléaires Neutrophiles 75%,Lymphocytes 15%,Monocytes 5 %,Promyélocytes 2%, Myélocytes 5%, et Erythroblastes 5 pour cent GB rencontrés. Cependant les éryhthroblastes ont été dénombrés lors de la numération automatisée des GB, comme des cellules nuclées, et il est nécessaire d'effectuer une correction de cette numération, si %age d’Erythroblaste est très élevé, et nombre GB faible, afin qu’elle ne corresponde uniquement qu’à celle des leucocytes. GB réels =(Num GB automate x100) / (100 + % Erythroblaste)

Atlas d’images cytologiques en Hématologie http://bioimage.free.fr/ http://www.med.univ-tours.fr/fmc/Pages/hemato.html http://www.med.univ-angers.fr/discipline/lab_hema/

Formule automatisée: Les automates réalisent une analyse en flux d'une quantité beaucoup plus grande de cellules selon différents critères physiques (diffraction lumineuse avec mesure à différents angles, conductance de signaux électriques...). L'étude informatique des éléments obtenus permet dans de nombreux cas de rendre la formule leucocytaire. Mais la présence d'anomalies cytologiques érythrocytaires, leucocytaires et/ou thrombocytaires nécessitera l'analyse microscopique d'un frottis sanguin coloré

Présence d’éléments médullaires dans le sang périphérique Erythroblastes : souvent E. acidophile et E. polychromatophile A compter au cours de la FL, mais ne pas inclure dans le % Ex: PN 80%, L 15%, M 5 %, et Erythroblastes 5% Si % Erythroblaste très élevé, et nombre GB faible: correction de la numération automatisée des GB: N GB =(Num GB automate x100) / (100 + % Erythroblaste)

Aspect général : taille 7,3 µm en moyenne, forme ronde Globules rouges Noyau : absent Cytoplasme : affinité acidophile, gris rosé à centre décoloré, sans granulations

Aspect général : taille 1 à 3 µm plus grosses sur anticoagulant forme irrégulière Plaquettes Noyau : absent Cytoplasme : affinité basophile clair, granulations fines indiscernables nombreuses azurophiles

Granulocyte ou polynucléaire neutrophile (PN) Aspect général : taille 12 à 14 µm forme arrondie Granulocyte ou polynucléaire neutrophile (PN) Noyau : taille N/P = 1 deux à six (le plus souvent deux ou trois lobes) chromatine dense à mottes allongées Cytoplasme : affinité acidophile clair granulations très nombreuses, fines, irrégulières dispersées et neutrophiles

Granulocyte ou polynucléaire eosinophile (PE) Aspect général : taille 12 à 14 µm forme arrondie Granulocyte ou polynucléaire eosinophile (PE) Noyau : taille N/P = 1 le plus souvent deux ou trois lobes chromatine dense à mottes allongées Cytoplasme : affinité acidophile clair granulations moyennes, rondes, nombreuses, parsemant le cytoplasme

Granulocyte ou polynucléaire basophile (PB) Aspect général : taille 11 à 13 µm forme arrondie Granulocyte ou polynucléaire basophile (PB) Noyau : taille N/P > 1 deux ou quatre lobes ronds se recouvrant chromatine dense à mottes allongées Cytoplasme : affinité acidophile clair granulations peu nombreuses, recouvrant partiellement le noyau, parsemant le cytoplasme, violet-noir

Aspect général : taille 9 à 11 µm forme arrondie Petit Lymphocyte Noyau : taille N/P >> 1 rond, chromatine dense Cytoplasme : mince couronne périnucléaire, affinité basophile clair, sans granulations

Aspect général : taille 10 à 15 µm forme arrondie mais déformable, souvent des côtés plats Grand Lymphocyte Noyau : taille N/P >= 1 rond, chromatine légère, mais d’aspect lisse Cytoplasme : affinité basophile clair, presque transparent, renforcement basophilie périphérique sans granulations ou avec quelques granulations azurophiles

Monocyte Aspect général : taille 18 à 21 µm forme arrondie mais très déformable, Noyau : taille N/P < 1 forme très variable, souvent encoché, chromatine légère et filamenteuse Cytoplasme : affinité basophile clair, avec granulations indiscernables azurophiles mais très nombreuses donnant un aspect de cytoplasme gris sale, vacuolé parfois

ANOMALIES MORPHOLOGIQUES DES GR Anomalies de Taille Macrocytose Microcytose Anisocytose

Anomalies de forme Dacryocytes, poires Ovalocytes Schizocytes Sphérocytes Drépanocytes

Anomalies de coloration Hypochromie Hématies cibles Polychromatophilie

Inclusions Ponctuations basophiles Corps de Jolly Faux-ami: Trophozoïte de Plasmodium Anneau de Cabot

ANOMALIES MORPHOLOGIQUES DES PLAQUETTES Plaquette géante Agrégat plaquettaire

Éléments cellulaires médullaires de la lignée granulocytaire A compter lors de la formule leucocytaire et à inclure dans le % Métamyélocytes N Myélocytes N Promyélocyte N Myéloblaste

Aspect général : taille  20 à 25 µm forme arrondie ou ovalaire Noyau : taille : N/P >>1  forme : arrondie (un peu aplati) aspect de la chromatine: légère et uniforme avec présence de nucléoles Cytoplasme : affinité basophile avec parfois, quelques granulations moyennes et azurophiles Myéloblaste

Promyélocyte neutrophile Aspect général : taille 18 à 22 µm forme ovalaire Noyau : taille : N/P > 1 forme : ovalaire (voire aplatie même encochée) aspect de la chromatine : légère et nucléolée avec possibilité de quelques masses de condensation Cytoplasme : affinité basophile soutenue présence de nombreuses granulations moyennes et azurophiles (quelques granulations spécifiques possibles) Promyélocyte neutrophile

Myélocyte neutrophile Aspect général : taille 15 à 18 µm forme ronde à ovalaire Noyau : taille : N/P = 1 forme : ronde, ovalaire aplatie, même encochée aspect de la chromatine : assez dense avec masses de condensation Cytoplasme : affinité acidophile ou basophile très clair présence de nombreuses granulations spécifiques neutrophiles de taille irrégulière, et encore quelques granulations azurophiles

Métamyélocyte neutrophile Aspect général : taille 13 à 15 µm forme arrondie à ovalaire Noyau : taille : N/P = 1 forme : incurvé ou droit, sans rétrécissement, pas de lobulation aspect de la chromatine : dense avec masses de condensation Cytoplasme : affinité acidophile avec présence de nombreuses granulations spécifiques neutrophiles de taille irrégulières Métamyélocyte neutrophile

Lymphocyte hyperbasophile Plasmocyte A inclure dans le % de la FL Lymphocytes hyperbasophiles apparaissent dans des infections virales ou parasitaires : syndromes mononucléosiques, souvent l’hyperlymphocytose est polymorphe Lymphocyte hyperbasophile