Pathologie des cancers du sein Classification histopathologique Caractères histopronostiques Marqueurs biologiques Dr Xavier Sastre-Garau, Département de Biopathologie, Institut Curie, Paris xavier.sastre@curie.net

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Histologie mammaire canal lobule Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Histologie mammaire: canal Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Histologie mammaire: lobule Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspects marcroscopiques des cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspects macroscopiques des cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Classification histologique Les cancers infiltrants - carcinome canalaire infiltrants 85% - carcinome lobulaire infiltrant 10% - carcinome médullaire 1% - carcinome mucineux 2% - autres types 3% Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome canalaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome canalaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Perte de la E-Cadhérine dans les carcinomes lobulaires Carcinome canalaire Carcinome lobulaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome mucineux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome mucineux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome apocrine Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Caractères histopronostiques Taille Grade: différenciation, atypies, mitoses Embolies tumorales Statut ganglionnaire: méthodes d’analyse du ganglion sentinelle Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique Différenciation 1: > 75% de formation glandulaires 2: 10-75% de formations glandulaires 3: <10% de formations glandulaires Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome bien différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome bien différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome peu différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique Pléomorphisme nucléaire 1: noyaux petits, réguliers, uniformes 2: noyaux modérément pléomorphes 3: noyaux atypiques et nucléolés Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronotique Index mitotique sur 10 champs consécutifs (X400) 1: de 0 à 10 mitoses 2 : de 11 à 22 mitoses 3 : > 22 mitoses Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Index mitotique Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique (Index de Nottingham) Grade 1: score global = 3, 4 ou 5 Grade 2: score global = 6 ou 7 Score 3: score global = 8 ou 9 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de survie sans métastase en fonction du grade histopronostique Survival rate 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 24 60 120 180 240 300 grade I grade II grade III Survival rate 0.5 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Embolies tumorales Lymphatiques ou veineuses Critères diagnostiques stricts En périphérie de la tumeur Valeur pronostique péjorative Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Embolies lymphatiques Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Embolies lymphatiques Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Extension métastatique ganglionnaire axillaire Terminologie TNM Taille Technique métastase pN1 > 2 mm standard micro métastase pN1mi 0.2-2 mm Métastase occulte pN0 (i+) < 0.2 mm immunohistochimie Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation histopathologique des ganglions sentinelles axillaires Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation per-opératoire des ganglions sentinelles Section médiane du ganglion Analyse microscopique d’une cryocoupe Si métastase: curage axillaire d’emblée Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation histopathologique des GS Analyse de 3 sections histo-logiques standard pour la détection de métastase ou micro-métastase immunohistochimie pour la détection des métastases occultes Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Métastase occulte dans un GS axillaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

149 SN 74 patients Number of sections with immuno-labelled cells Number of new positive cases successively disclosed at each level HES 20 / 74 150 m IHC1 23/149 7 / 74 IHC2 22/149 6 / 74 IHC3 23/149 1 / 74 IHC4 17/149 0 / 74 IHC5 15/149 1 / 74 IHC6 7 /149 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris 107 / 894 (12%) 35 / 74 (47.3%)

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Analyse des GS axillaires à l’aide de sections histologiques sériées et par immunohistochimie Test sensible La plupart des évènements détectés à l’aide de 3 sections Procédure adaptée à l’étude des étapes précoces de la dissémination tumorale Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Analyse des GS axillaires série prospective de 879 cas Métastases: 14.4% (127/879) Micro-métastases: 9.1% (80/879) Métastases occultes: 6.5% (57/879) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de survie sans métastase en fonction du statut ganglionnaire Survival rate 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 24 60 120 180 240 300 N - 1-3 N+ >3 N+ Survival rate 0.5 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut CurieParis

extension métastatique précoce Cancers du sein : extension métastatique précoce dans la moelle osseuse Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspiration de la moelle en per-opératoire Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité Numération Cytospots (106 cellules/lame) Immuno-cyto-chimie Analyse microscopique Résultats (287 cas) (2001-2004) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Mo 358 Mo 753 Métastases occultes Mo 381 Mo 695 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Cellules cytokératines positives de signification indéterminée (CK+) Mo 817 Mo 817 Cellules cytokératines positives de signification indéterminée (CK+) Mo 728 Mo 728 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Extension ostéo-médullaire précoce Taux de métastases occultes dans la moelle osseuse au moment du traitement initial des tumeurs mammaires de petite taille: 15.3% (44/287) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Comparaison entre le statut médullaire et le statut du GS axillaire Ganglion sentinelle N° de cas Moelle osseuse p negative CK+ métastase occulte négatif 174 60 (34.5%) 89 (51.1%) 25 (14.4%) 0.5 métastase 53 24 (45.3%) 19 (35.8%) 10 (18.9%) micro métastase 22 9 (40.9%) 10 (45.5%) 3 (13.6%) Métastase occulte 25 11 (44.0%) 9 (36.0%) 5 (20.0%) 274 104 127 43 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

L’extension métastatique ganglionnaire axillaire n’est pas une étape nécessaire à l’extension métastatique ostéo-médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Marqueurs biologiques en pathologie mammaire Récepteurs aux oestrogènes Récepteur à la progestérone c-erb B-2 Prolifération (Ki67) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Récepteurs aux oestrogènes : méthode immunohistochimique Dr X Sastre-Garau Institut Curie, Paris Carcinome lobulaire infiltrant

Récepteurs à la progestérone : méthode immunohistochimique RP Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome mucineux

Taux de prolifération (mib1) Ki 67 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Amplification et surexpression de HER2 Définition de l’amplification génique Correlation entre amplification et surexpression: deux types d’analyses Stratégie pour détermination du statut HER2 Aspects pratiques et recommandations Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

HER2 oncogène, localisé en 17q21 Activation par amplification Surexpression protéique L ’oncogène HER2/neu appelé également ERBB2 est l ’un des oncogènes important du processus de tumorigenèse mammaire. Il est situé sur le bras long du chromosome 17 Il est activé dans 15 à 30% des cancers du sein. Son activation correspond à une amplification c ’est à dire la présence d ’un grand nombre de copies deHER2/neu dans le noyau des cellules tumorales. Il n ’a pas été décrit d ’autre processus d ’activation du gène HER2/neu en particulier pas de mutation ni de translocation L ’amplification s ’accompagne dans la très grande majorité des cas d ’une surexpression de la protéine Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Détermination du statut HER2 Statut génomique → Statut du gène Hybridation in situ en fluorescence (FISH) Statut d’expression → Statut de la protéine Immunohistochimie (IHC) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Amplifications Duplications d’un gène ou d’un groupe de gènes (amplicon) en de multiples copies (généralement plus de 10), indépendamment des gènes adjacents Deux formes au niveau chromosomique: - double minutes (dm) MYCN in neuroblastoma - homogeneously staining regions (hsr) HER2 dans les cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Caryotype d’un cancer mammaire Amplification de HER-2: hsr FISH HER-2 hybridization on hsr hsr Document M. Muléris Caryotype d’un cancer mammaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Les cellules tumorales sont souvent aneuploïdes… Surtout dans les carcinomes de haut grade polyploïdies polysomies, monosomies translocations déséquilibrées Sur-représentations chromosomiques HER-2: 17q21.1 A. AURIAS A. Aurias Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris FISH HER2 HER-2 cen 17 noyau métaphase cen 17 HER-2 Amplification de HER2 sur- représentation du chromosome 17 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Surexpression fortes secondaires à amplification Surexpression de la protéine HER2 Amplification du gène HER2 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Statut de HER2 et traitement anti-HER2 Seulement les amplifications de HER2 amplification conduisent à un haut niveau (>10x) de surexpression de la protéine HER2 Les sur-representations conduisent à un faible niveau (<3x) de surexpression de la protéine La cible du Trastuzumab est la protéine HER2 avec haut niveau d’expression (IHC 3+) La réponse au Trastuzumab des cancers mammaires avec faible niveau de surexpresison de la protéine HER2 n’est pas documentée  But: pour l’efficacité thérapeutique, détecter les haut niveaux de surexpression correspondant à une amplification génique Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Stratégie pour l’analyse du statut de HER2 IHC ou FISH ? IHC comme première étape IHC: technique fiable après calibration par la FISH Problèmes non résolus: - altération possible d’épitopes après fixation - artéfacts potentiels avec marquage non spécifique - intensité de marquage correspondant à une variable continue pouvant être difficile à répartir par classe - incomplete consensus on the rate of labeled cells Indications de FISH restreintes aux cas 2+ par IHC Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

IHC HER2: Recommandations Standardisation des procédures de fixation et de préparation des sections histologiques Automatisation Calibration par la FISH Contrôles inclus dans toutes les analyses Règles d’interprétation Contrôles de qualité interne et externe (AFAQAP, UKNEQUAS) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Calibration de l’IHC Calibration de la procédure FISH contrôles positifs et négatifs systématiques Importance majeure du pH du tampon pour le dénaturation thermique (pH : 6) Forte dilution de l’anticorps primaire CB11 : 1/500 à 1/800 A0485 : 1/ 1500 à 1/2000 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Contrôles Négatif Canaux normaux Positif PAGET Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Régles d’interprétation Score Immunomarquage Herceptin® Pas de cellules marquée ou < 10% non 1+ Marquage faible et incomplet de >10% to 50-60% cellules no 2+ Marquage faible ou modéré mais complet et dans > 60% cellules Oui seulement si amplification prouvée par FISH 3+ Marquage fort et complet dans > 60% cellules oui Vincent-Salomon et al., 42:337-47, Histopathology, 2003 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de positivité attendus comme contrôle de qualité interne Canalaire < 2 cm 10 to 15% > 2 cm 20 to 25% grade I 0% grade II 11% grade III 27% Inflammatoire Femme de moins de 35 ans Lobulaire < 5% De nombreuses études se sont intéressées à HER2 comme marqueur en oncologie mammaire. L ’ensemble des données publiées montre qu e HER2 est un marqueur de progression tumorale. Lobulaires En effet dans les cancers canalaires de moins de 2cm, la surexpression n ’est observée que dans 10 à 15% des cas , dans ceux de plus de 2cm, elle est de 20 à 25% Dans les formes de présentation clinique grave sein inflammatoire et cancer de la femme jeune, cette surexpression est observée dans au moins 30% des cas. De façon paradoxale dans les cancers in situ , la sure^pression est de 40% et de 90% dans les maladie de Paget. 30% Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Surexpression forte de HER2 (+++) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Amplification forte de HER2 (> 15 copies)

Surexpression modérée de HER2 (++) La surexpression de l a protéineHER2 est spécifique des cellules tumorales. Il s ’agit d ’ une protéine trans-membranaire qui appartient à la famille du récepteur de l ’EGF qui participe à la transduction du signal mitotique et donc à la croissance tumorale. Elle représente la cible d ’u n traitement spécifique antiHER2. Amplification faible (8 – 10 copies) de HER2 ? Sur-representation sans amplification? Amplification forte mais altération de l’épitope ? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

FISH pour la détermination du statut de HER2 Technique fiable - reproductibilité supérieure à celle de l’IHC - échecs identifiables - variable discontinue (résultat numérique) Plusieurs limitations: équipement onéreux pour l’analyse microscopique coût de l’analyse (135 €) plus élevé que celui de l’IHC Formation spécifique requise Deux indications en pratique: calibration de l’IHC détermination du statut de HER2 dans les cas IHC 2+ Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris FISH HER2 Deux types de kits approuvés par la FDA - HER2 probe seule  numbre de copies de HER2 - mélange des sondes HER-2 + cen 17  taux entre HER2 / cen 17 copies Buts: dans les cas d’immunomarquage ambigue, (++), (1) distinguer amplifications et sur-representations (2) éliminer de potentiels artéfacts Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Seuils pour un diagnostic d’amplification (littérature) Variable: de ≥ 4 to ≥ 6 copies HER2 (≥ 2 à ≥ 3 HER-2/cen 17) La plupart des études: Kit HER2 : . 1-4 copies: Pas d’amplification . ≥ 5 copies: Amplification kit HER2/cen 17: . HER2/cen 17 ≤ 2.2: pas d’amplification . HER2/cen 17 >2.2 : Amplification  seuil bas et arbitraire, non basé sur un rationel genetique  des sur-representations peuvent être rapportées comme des amplifications Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

FISH HER2: recommandations But: détecter de vraies amplifications conduisant à une surexpression forte - HER2: > 6 copies - HER2/cen 17: >3 Présence d’amas de signaux (hsr) signant l’amplification. Préciser le nombre de signaux de HER2 Vérifier le ratio HER2/cen 17 si 6-7 HER2 copies Garder des images pour contrôle de qualité Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Trastuzumab® + chimiothérapie Sélection des patientes pour le traitement anti-HER2 (Institut Curie 2000-2005) IMMUNOHISTOCHIMIE (4697 cas) Pas de surexpression : 80 % Surexpression: 20% Forte (3+) 64% Modérée (2+) 36% FISH Amplification 40% 56% 8-12 copies 44% >15 copies Trastuzumab® + chimiothérapie Pas d’amplification 60% Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Les carcinomes triple négatifs Définition immunophénotypique RO- RP- ERBB2- Carcinome canalaire infiltrant de haut grade Types histologiques spécifiques Carcinome apocrine Carcinome lobulaire pléomorphe… Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Les carcinomes de type basal-like Un sous groupe des carcinomes « triple négatifs » Immunophénotype caractéristique Cytokératine 5/6 + ; EGFR + ; P53 + Carcinome canalaire infiltrant de haut grade Types histologiques spécifiques Médullaire BRCA1/2 associé Autres: sécrétoire, adénoïde kystique, myoépithélial… Indications thérapeutiques spécifiques ? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Carcinome médullaire RO Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de survie sans métastase en fonction du statut des RO Survival rate 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 24 60 120 180 240 300 ER - ER + Survival rate 0.5 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Analyse histopathologique des cancers du sein Remarques générales Forces Phénotype + immunophénotype à valeur pronostique et prédictive: Robustesse, simplicité, spécificité, coût minime Limites Les cancers triples négatifs, Extension systémique minime: maladie micrométastatique, Nouveaux marqueurs moléculaires pronostiques et prédictifs ? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris