INRA Pierroton- Equipe de Génétique Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à un stress osmotique Philippe CHAUMEIL 13 avril 2006 UMR BIOGECO INRA Pierroton- Equipe de Génétique

Pin maritime (Pinus pinaster (Ait.)) 25% production nationale de bois de résineux Sylviculture intensive peuplement monospécifique Aire naturelle 4 Millions hectares En Aquitaine : Intérêt économique et écologique Âge de rotation : 35-50 ans Bois d’œuvre Construction Pâte à papier Palettes emballages

Amélioration du Pin maritime Gestion des ressources génétiques et création de variétés améliorées 1960 - Rendement - Rectitude Gains supérieurs à 30 %

Augmentation des températures estivales Evolution du climat mondial Evolution des températures à l’échelle du siècle Augmentation des températures estivales automne +4°C

Evolution du climat mondial Evolution des précipitations à l’échelle du siècle +40mm -10mm Hivers plus humides Etés plus secs -50mm -30mm

Impacts climatiques Précipitations annuelles 2001 2002 2003 2004 -25% -50% -25% -25% 25-30 000 ha en dépérissement dans les landes Nécessité de prendre en compte l’adaptation des variétés améliorées aux conditions climatiques à venir

Adaptation à l’environnement de la réponse au stress hydrique Des nouveaux critères à prendre en compte 1995…..Recherche des déterminants génétiques de caractères adaptatifs : Adaptation à l’environnement Etudes Physiologiques Génétiques Moléculaires de la réponse au stress hydrique Améliorer la résistance à la sécheresse des variétés Développement durable du massif forestier

Résistance à la sécheresse Quels sont les mécanismes de résistance à la sécheresse ? échappement évitement tolérance Stratégies de résistance :

Réponses physiologiques au stress hydrique Pin maritime Variabilité phénotypique (ex: pression de sève, transpiration, teneur en eau) Variabilité physiologique (ex gs, E, ψs, ψh, TRE, croissance …) Modélisation du bilan hydrique au sein d’une parcelle Régulation stomatique Conductance hydraulique Stress Hydrique Espèce évitante Variabilité de réponse à la sécheresse entre Ecotypes, + ou - tolérants Développement racinaire Hormones du stress (ethylène, ABA, PA)

Déterminisme génétique de la réponse au stress hydrique Approches physiologie / génétique Variabilité génétique et héritabilité de l’efficacité d’utilisation de l’eau ? Contrôle génétique de l’efficacité d’utilisation de l’eau : Détection de QTL Héritabilité du caractère

Réponses moléculaires au stress hydrique Modifications de l’expression des gènes : Plasticité du protéome (thèse de Costa) Plasticité du transcriptome (thèse de Dubos) Pin maritime Détoxification Chaperonne Osmorégulation Stress Hydrique Transduction du signal Modification structurale Régulation transcription 5

Diversité de réponse à la contrainte Il existe une diversité intra-spécifique pour le niveau de résistance à la sécheresse Entre individus Entre populations Phénotypes sensibles Phénotypes résistants

Efficacité d’utilisation de l’eau Diversité de réponse chez le pin maritime 2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu Efficacité d’utilisation de l’eau France Maroc 650mm 980mm Tolérance + -

P = G + E + GxE Origine de la variabilité phénotypique Qu’est ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

P = G + E + GxE Origine de la variabilité phénotypique Qu’est ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

P = G + E + GxE Plasticité phénotypique et moléculaire Phénotype Génotype Environnement Interaction Plasticité phénotypique: capacité d’un génotype à modifier son phénotype dans des environnements différents Par analogie… Plasticité moléculaire: capacité d’un génotype à modifier l’expression de son génome dans des environnements différents

P = G + E + GxE Origine de la variabilité phénotypique Qu’est ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

[Individu ou Population/Ecotype ou espèce] Les normes de réaction Une façon simple de représenter P = G + E + GxE P G Unité Génétique (G) : [Individu ou Population/Ecotype ou espèce] E La valeur P d’un G au travers des E

Détection de gènes de réponse au stress Les normes de réaction 1 seule Unité Génétique (UG) : [Individu ou Population/Ecotype ou espèce] P = G + E + GxE Phénotype E1 E2 Détection de gènes de réponse au stress PLASTICITE Valeur adaptative de cette plasticité ?

Au moins 2 Unités Génétiques (G) Les normes de réaction Au moins 2 Unités Génétiques (G) P = G + E + GxE ex: sensible vs résistant Expression Env1 Env2 G1 G2 E G Expression Env1 Env2 Expression Env1 Env2 G+E Expression Env1 Env2 G+E+GxE Expression Env1 Env2 G+E Expression Env1 Env2 GxE

Les normes de réaction Mise en évidence de stratégies de réponses différentes entre les génotypes Expression Env1 Env2 G1 G2 E G Expression Env1 Env2 Expression Env1 Env2 G+E Expression Env1 Env2 G+E+GxE Expression Env1 Env2 G+E Expression Env1 Env2 GxE

Objectif Identifier les gènes impliqués dans l’adaptation à la sécheresse chez le pin maritime Hypothèse : Les gènes qui présentent ces normes de réaction sont liés à l’adaptation des populations à leur environnement

Questions de recherche 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique? 2. Est-il possible d’identifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans l’adaptation au stress hydrique?

Ressources nécessaires Pour répondre à ces questions 1. Développement d’une ressource génomique 2. Obtention du matériel végétal 3. Acquisition des données d’expression du génome

Ressources nécessaires 1. Développement d’une ressource génomique Méthode : Création de banques d’ADNc et séquençage d’EST Identification de la fonction des gènes

Séquences d’ADNc (EST) Gènes exprimés : séquençage EST Principe ? Banque d’ADNc Séquences d’ADNc (EST) Extraction d’ARNm Quel matériel végétal utiliser pour une bonne représentativité des banques d’ADNc ?

Banques d’ADNc Xylème en différentiation 8 260 EST Un type cellulaire majoritaire chez le pin (trachéides) Rôle de soutien et de conduction de l’eau et des minéraux Le bois : un bio-indicateur des conditions hydriques 8 260 EST Racines de plantules (Stress / Contrôle ) Les racines : 1er organe à percevoir une sécheresse édaphique Rôle d’ancrage et de captage de l’eau et des nutriments 10 238 EST

Assemblage et annotation des Séquences Création projet Repeat masker Assemblage Pipeline bioinformatique EST D2 Cluster famille de gène ou gène singletons CL1 CL2 CL3 CL… CL10 Phrap CT12 CT13 CT14 Membres (paralogues) Craw CN58 CN56 CN57 Allèles? Épissage? CN59 - Consultation - Étape d’Annotation Interface d’annotation

Création d’un Unigène de 7200 gènes : Réalisation d’un Unigène 18498 EST assemblées en : 2697 Clusters 2893 Contigs 5051 Singletons Création d’un Unigène de 7200 gènes : 4236 Singletons 2889 Consensus

Ressources nécessaires 2. Obtention du matériel végétal Doit permettre d’identifier : Les gènes impliqués dans l’adaptation au stress hydrique De détecter les gènes de la réponse précoce et ceux impliqués dans un stress établi

Matériel végétal : 2 Ecotypes aux comportements tranchés Gènes impliqués dans l’adaptation au stress hydrique ? Gènes de la réponse précoce / gènes du stress établi ? 2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu 2 types de stress : Court et violent Prolongé et modéré

Choix d’une culture hydroponique Matériel végétal : culture hydroponique Choix d’une culture hydroponique Osmoticum = PEG

Matériel végétal : Choix des conditions expérimentales Stress court -0.60 MPa Témoin court +2H +6H +24H +48H Application du stress Hydroponie Germination Stress Long -0.45 MPa +3 semaines Témoin long

Mesure du potentiel de base Matériel végétal : application du stress osmotique Germination Salle de culture Eclairage Mesure du potentiel de base Stress court Stress long témoin stress Traitement appliqué induit bien un stress Une différence entre Ecotypes en stress long

Ressources nécessaires 3. Acquisition des données d’expression du génome 3.1. Réalisation d’une puce à ADNc 3.2. Quantification de l’accumulation des transcrits

Réalisation d’une puce à ADNc Fabrication Gènes (EST) + lame de verre Dépôt « spotting »

Transcription des ARNm Réalisation d’une puce à ADNc Fabrication Ech 1 Analyse des résultats Hybridation et lecture Ech 2 Extraction des ARN Transcription des ARNm en ADNc et marquage Cy3 Cy5 Hybridation Gènes (EST) + lame de verre Dépôt « spotting »

Quantification de l’accumulation des transcrits: Plan d’expérience Choix du schéma d’hybridation essentiel : dépend du nombre d’échantillons à comparer détermine le coût de l’expérience doit permettre d’estimer les effets expérimentaux détermine la puissance de détection des variations d’expression « loop » A B C A,B,C : 3 échantillons : lame Hybridations selon un « Loop design » Avantages Inconvénients Nb de lames réduit Estimation des effets plus précise Sensibilité aux données manquantes

Quantification de l’accumulation des transcrits: Plan d’expérience Réponse à court terme Témoin Stress 6h Stress 48h 18 lames Réponse à long terme Témoin Stress 8 lames Pas de pont entre les 2 expériences Nombre de lames limité (30) Limiter le risque des manips Réponse « stress court » vs. « stress long »

Quantification de l’accumulation des transcrits: analyse biométrique 1/ Normalisation intra-lame, « rlowess » (MAANOVA) : normalise signal Cy3/Cy5 tient compte de la position des spots 2/ Normalisation inter-lames modèle global (gènes = répétitions) : résiduelle lame fluorochrome Biais techniques Écotype Condition Correction technique liée à l’E et à la condition 3/ Obtention de données d’expression corrigées

1. Développement d’une ressource génomique Pour résumer… 1. Développement d’une ressource génomique 20 000 EST annotées et Unigène de 7200 éléments 2. Obtention du matériel végétal 2 Ecotypes x 5 conditions 3. Acquisition des données d’expression du génome 700 000 données !

Questions de recherche 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique? 2. Est-il possible d’identifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans l’adaptation au stress hydrique?

Question de recherche n°1 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensibles vs tolérants lors du stress hydrique? Méthode : Utilisation des données d’expression de puces à ADNc Détection des gènes différentiellement exprimés par ANOVA (effet Ecotype, effet environnement, interaction)

Détection des gènes différentiellement exprimés : Analyse de variance Détection des gènes différentiellement exprimés : Effets techniques Ecotype condition Prise en compte de la multiplicité des tests dans l’erreur globale de type 1 7200 tests ! Utilisation de la méthode FDR: « False Discovering Rate » part de variation expliquée par facteurs G + E + GE >40% ou 1/3 variation expliquée par un des trois facteurs seuil de probabilité de 0,01 pour au moins un des facteurs

Analyse de variance: résultats Nombre de gènes différentiellement exprimés : Expérience « Stress court » = 458 gènes Expérience « Stress long » = 612 gènes Quels sont les effets significatifs majeurs ? Stress Court Stress Long effet significatif Condition (E) 15% 82% (504) Ecotype (G) 64% (292) 4% Ecotype+Condition (G+E) 19% 8% Interaction seule (GxE) 0,2% 0%

Regroupement des échantillons sur la base d’une distance transcriptomique Euclidienne Stress court = regroupement par Ecotype 458 gènes Stress long = regroupement par condition 612 gènes

Amplitude de régulation Stress Court Stress Long Ratios G E 3 1 20 64 5 24 220 256 36 224 58 68 11 82 14 6 4 ≤ 1,25 1,5 2 3 4 5 ≥ Amplitude de régulation : Ex: HSP, +6,62x Small HSP, +5,48x Protéines de membranes induites par l’ABA, +3,92x Déhydrine, +3,21 Précurseurs de peroxydases, -3,2 à -6,59x LEA, +3,02x HSP classe I, +4,16x Small HSP, +3,22x Flavonoid 3',5'-hydroxylase, +6,72x Gènes de fonctions connues pour leur implication dans la réponse au stress et de nombreux gènes de fonctions inconnues

Questions de recherche n°2 2. Est-il possible d’identifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans l’adaptation au stress hydrique? Méthode : Méthodes de regroupement des données

Gènes différentiellement exprimés Gènes différentiellement exprimés Agrégation des données (Clustering) Stress court Gènes différentiellement exprimés Stress Long Gènes différentiellement exprimés Méthodes visant à maximiser l’homogénéité intra-groupe et à minimiser l’homogénéité inter-groupe Clustering Expander «Click » : http://www.cs.tau.ac.il/~rshamir/expander/expander.html Regrouper les gènes dont le profil d’expression est similaire

Agrégation des données (Clustering) Résultats 612 Gènes 458 Gènes 6 profils en « Stress Court » 7 profils en « Stress Long »

Agrégation des données (Clustering) Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » Cluster 1 :181 Cluster 2 :107 Cluster 1 :219 Cluster 2 :192 Cluster 3 :41 Cluster 3 :70 Cluster 4 :33 Cluster 4 :39 Cluster 5 :34 Cluster 6 :29 TL SL TL SL Cluster 5 :23 Cluster 6 :22 Cluster 7 :21 TL SL Tc 6H 48H Tc 6H 48H

Agrégation des données (Clustering) Existe-t-il des gènes caractéristiques de la plasticité moléculaire ? Expression Ctrl Stress E1 E2 E Réponses similaires entre Ecotypes = gènes à comportement plastique

Profil « Condition » Agrégation des données (Clustering) 45 gènes Expression Ctrl Stress E1 E2 Profil « Condition » Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » 411 gènes TL SL TL SL 45 gènes Tc 6H 48H Tc 6H 48H

Gènes régulés par le stress quel que soit l’Ecotype Expression Ctrl Stress E1 E2 Détection des gènes classiquement décrits lors du stress hydrique Ex : Déhydrine Protéines de réponse à l’éthylène HSP ASR LEA protéine à 7 domaines transmembranaires récepteur protéine kinase … Permettent d’étudier les mécanismes de la réponse au stress

Variabilité entre Ecotype Existe-t-il des gènes caractéristiques des Ecotypes ? Expression Ctrl Stress G

Variabilité entre Ecotype Quelle est l’origine de la différence de régulation entre populations différentes ? Dérive génétique Sélection naturelle Écotype marocain exposé à une sécheresse chronique Différentiel d’expression peut apporter un avantage sélectif Gènes de l’adaptation ?

Profil « Écotype » Agrégation des données (Clustering) Expression Ctrl Stress Profil « Écotype » Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » Tc 6H 48H Tc 6H 48H TL SL

Gènes différenciant les deux Ecotypes Ex: Ecotype français : PAL Pectates lyases Glucane endo-1,3-beta glucosidase Bétaïne-aldéhyde déshydrogénase Composition des parois Osmoprotection Expression Ctrl Stress Hypothèse : Stratégies adaptatives différentes Ecotype marocain : Glutathione transférase Précurseur de la peroxydase Thioredoxine type H Peptidyl prolyl Isomérase Carbonate déshydratase Proton-exporting ATPase Détoxification Transport ionique Stabilisation protéique Expression Ctrl Stress

Gènes impliqués dans l’adaptation Quels sont les gènes qui montrent des stratégies de réponse au stress (E) différentes entre Ecotypes (G) ? H0: gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation au stress hydrique Expression Env1 Env2 G+E Expression Env1 Env2 GxE Expression Env1 Env2 G+E+GxE

Profil « Ecotype + Condition» Gènes impliqués dans l’adaptation Profil « Ecotype + Condition» Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » Tc 6H 48H TL SL TL SL TL SL Tc 6H 48H

Gènes impliqués dans l’adaptation Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » Gènes plus fortement exprimés chez l’Ecotype marocain Tc 6H 48H TL SL TL SL TL SL Tc 6H 48H

Gènes impliqués dans l’adaptation Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » TL SL Tc 6H 48H gènes surexprimés par le stress, + Marocains

Gènes impliqués dans l’adaptation Expression Ctrl Stress Ex : Gènes surexprimés, plus fortement exprimés chez l’Ecotype marocain Protéines de choc thermique (HSP), protéine induite par l’ ABA, LEA, Métallothionéines, Synthèse flavonoïdes… Réponse au stress Caractéristique de la réponse de l’Ecotype marocain ? Régulation de l’expression et synthèse des protéines Phospholipase D RING finger, Zinc finger, G-box binding factor, Histone H4 Elongation factor 1-gamma, … Composition parois Cellulose synthase Elastine-like

Gènes impliqués dans l’adaptation Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » gènes surexprimés par le stress, + Français

Gènes impliqués dans l’adaptation Expression Ctrl Stress Ex : Gènes surexprimés, plus fortement exprimés chez l’Ecotype français Peptides antimicrobiens, Aluminium-induced protein-like, précurseur de péroxydase, cytochrome P450, protéines chaperonnes dnaJ… Stratégie de maintien du métabolisme ? Réponse au stress + métabolisme + fonction inconnue

Gènes impliqués dans l’adaptation Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » sous-expression, Ecotype marocain plus exprimé Tc 6H 48H

Gènes impliqués dans l’adaptation Expression Ctrl Stress Ex : Gènes sous-exprimés lors du stress, Niveau d’expression maintenu plus élevé chez l’Ecotype marocain Isopentenyl-diP delta-Isomérase 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-diP synthase Geranyl diP synthase Pinène synthase Synthèse des terpènes Cholinephosphate cytidyltransférase B Précurseur Bétaïne Bétaïne-aldéhyde déshydrogénase, plus exprimée chez l’Ecotype français Stratégies de régulation différentes de la Bétaïne ?

Gènes impliqués dans l’adaptation Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long » sous-expression, Ecotype français plus exprimé TL SL

Gènes impliqués dans l’adaptation Expression Ctrl Stress Ex : Gènes sous-exprimés lors du stress, mais plus exprimé Ecotype français Metallothionein-like protein EMB30 Disease resistance response protein Dehydratation stress-induced protein Réponse au stress Synthèse lignine C4H Caffeate O-methyltransferase PAL est également plus exprimée chez l’Ecotype français quelque soit condition Stratégies de régulation composition des parois différentes ?

Gènes impliqués dans l’adaptation Il existe d’autres normes de réaction…

Germin (oxalate oxidase)-like Métallothionéine -like Gènes impliqués dans l’adaptation 12 accessions de Pinus taeda 41 gènes 24 accessions très faiblement régulées 5 accessions à profil intéressant GxE G+E+GxE déshydrogénase Alcool oxygénase Inositol Germin (oxalate oxidase)-like Fonction inconnue Métallothionéine -like

Choline-P cytidyltransférase Synthèse: des gènes candidats de l’adaptation Carbonate déshydratase Proton exporting ATPase Choline-P cytidyltransférase Bétaine aldéhyde desH2 Bétaine Osmorégulation Histone H4 RING finger Zinc finger G-box binding factor Elongation factor 1 G Peptidilprolyl isomérase Régulation Expression IPP isomérase GPP synthase Pinène synthase DETOXIFICATION Peptide antimicrobien Aluminium induced prot-like Précurseur peroxydase Cytochrome P450 Protéine chaperonne dnaJ Inositol oxygenase HSP ABA induced protein LEA Métallothionéines Synthèse flavonoïde Disease resistance Dehydratation stress-induced S T R E S S PAL C4H COMT Pectate lyase Glucan endo1,3 beta glucosidase Cellulose synthase Elastine-like PAROIS Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Outil d’assemblage et d’annotation (EPA) Conclusions 1. Génération et mise à disposition d’une ressource d’EST annotées 10000 EST de racines 9000 EST de xylème 8000 EST de bourgeons = 27000 EST de pin maritime THESE Outil d’assemblage et d’annotation (EPA)

Conclusions 1. Génération et mise à disposition d’une ressource d’EST annotées 2. Production et utilisation d’une puce à ADNc pin maritime THESE Première fois chez cette espèce Maintenant, Unigène de 12000 gènes

Conclusions 1. Génération et mise à disposition d’une ressource d’EST annotées 2. Production et utilisation d’une puce à ADNc pin maritime THESE 3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL Fort effet Ecotype en stress court et fort effet condition en stress long

Conclusions Gènes candidats potentiels 1. Génération et mise à disposition d’une ressource d’EST annotées 2. Production et utilisation d’une puce à ADNc pin maritime THESE 3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL 4. Détection de gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation au stress hydrique Gènes candidats potentiels 5. Possibilité de stratégies de réponses différentes

Validation de gènes par qPCR sur plus d’Ecotypes Perspectives Validation de gènes par qPCR sur plus d’Ecotypes qPCR= technique adaptée pour les études ciblées (beaucoup de pop et peu de gènes) En cours … T29M8.12 protein (monooxygenase /disulfide oxidoreductase ) Test de provenance Différence d’expression entre Ecotypes plantés au champ et mesurés pour l’efficacité d’utilisation de l’eau

Perspectives Étudier la diversité nucléotidique pour un lot de gènes potentiellement liés à l’adaptation et analyser si la diversité observée est compatible avec un effet de la sélection naturelle (thèse en cours E Eveno, sur l’étude des patrons de diversité au sein de gènes candidats) Glycin-Rich Protein Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase Arabinogalactan /Prolin-Rich Protein Trans-cinnamate-4-hydroxylase (C4H) Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase putative dehydrin

Perspectives Caractériser la composition chimique des parois (coopération ISA Lisbonne) …en cours… cellulose min 10 20 30 40 50 60 70 80 TC TC témoin TL TL

Remerciements Christophe Plomion Patrick Léger Céline Lalanne Manon Moreau Christophe Boury Jean-marc Frigério … Johan Petit Virginie Garcia Aurélien Barré Nacer Mohellibi … Marie Foulongne Silvia Fluch Membres du jury : O. Brendel, P. Dizengremel, B. Garbay , P. Label, M. Zivy