Mesure d’une activité enzymatique et Détermination d’un substrat par voie enzymatique

PLAN Introduction Généralités sur les enzymes Cinétique enzymatique Modalités de détermination d’une activité enzymatique Dosage d’un substrat par voie enzymatique Applications Conclusion

INTRODUCTION Pour réaliser les réactions dont il est le siège, l’organisme se dispose des catalyseurs que l’on désigne sous le nom d’Enzymes. La répartition d’une enzyme dans les organes et dans les tissus est très irrégulière. En effet, l’activité enzymatique d’une enzyme peut être l’objet de divers variations physiologiques et pathologiques. Les progrès réalisés sur le plan métaboliques ainsi que biotechnologique ont pu exploité l’enzyme comme un réactif. Par conséquent, plus de spécificité et de sensibilité en matière de dosage des substrats métaboliques.

Généralités sur les enzymes Une enzyme est un catalyseur biologique qui augmente la vitesse d’une réaction en diminuant son énergie libre d’activation, sans être elle-même affectée. Une enzyme agit comme catalyseur en se liant au substrat et facilite sa réaction en stabilisant son état de transition vers un produit spécifique: Substrat(s) + enzyme → Produit(s)

Exemple: Hydrolyse des protéines par HCL ( 20Kcal) contre 12 Kcal par trypsine

Structure des enzymes Enzymes entièrement protéique: la ribonucléase par exemple. Enzymes formés de deux parties: Une partie protéique appelée apoenzyme thermolabile. Une partie non protéique appelée coenzyme thermostable. Les coenzymes sont groupés en 3 classes: Coenzymes tétrapyroliques : intervient dans les transferts d’électrons: NAD/FAD/NADP Coenzymes métalliques: Zn, Mn, Co, Mg Coenzymes dérivés de vitamines hydrosolubles: B1, B12, B2…

Spécificité des réactions enzymatiques Une des caractéristiques fondamentales des enzymes est leur spécificité comparativement aux catalyseurs chimiques. D’où la notion du site actif d’une enzyme On peut considérer que le site actif comporte deux sites voisins: Un site de fixation du substrat ou de reconnaissance : Spécificité de substrat Un site responsable de la réalisation de la réaction chimique ou le site catalytique: Spécificité de réaction

CLASSIFICATION DES ENZYMES Selon les réactions catalysées, les enzymes peuvent être classées dans six grandes catégories: 1. Oxydoréductases- qui catalysent des transferts d'électrons et de protons d’un donneur à un accepteur 2. Transférases- qui catalysent les transferts de groupements 3. Hydrolases- qui catalysent des réactions d'hydrolyse (coupure des liens C-C, C-O, C-N et autres par de l’eau) 4. Lyases- qui catalysent l'addition de groupes à des liens doubles ou l'inverse 5. Isomérases- qui catalysent le transfert de groupes dans une même molécule pour produire des formes isomères (ex. conversion d'un acide aminé L en acide aminé D) 6. Ligases- qui forment des liens C-C, C-S, C-O et C-N lors de réactions de condensation couplées à l'utilisation d'ATP

Nomenclature Chaque enzyme est assignée un code à quatre chiffres par la Commission des Enzymes (EC) de l’union International de Biochimie de Biochimie Moléculaire: Nom de l’enzyme (EC W.X.Y.Z) EC- système numérique de la commission des enzymes W- indique la réaction catalysée (1-6) X- indique le groupement donneur: celui du substrat sur lequel l’enzyme agit. Y- indique l’accepteur: la molécule qui recevra protons ou les éléctrons. coenzyme Z- indique la nature de substrat Ex : la lactate-NAD-oxydoréductase ( ou lactate déshydrogénase ) : EC1.1.1.27 : elle effectue une oxydoréduction sur une fonction alcool de l'acide lactique et c'est le NAD qui sera l'accepteur de H

III. Cinétique enzymatique L’étude cinétique d’une réaction enzymatique consiste en l’étude de la vitesse de la réaction et de l’influence de divers paramètres susceptibles de la modifiée. La vitesse d’une réaction enzymatique est la quantité de substrat transformé( ou de produit apparu) par unité de temps. Le phénomène fondamental de l’action enzymatique est que pour agir l’enzyme doit se combiner au substrat est transformé en produit et l’enzyme retrouve sa structure primitive: S + E ES P+ E

Ceci implique que Vo est proportionnelle à la [E] A. Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique en fonction du temps La réaction enzymatique peut être divisé en deux phases: Phase stationnaire correspond à la période initiale de la réaction au cours de la quelle la vitesse(Vo) est constante et indépendante de la concentration su substrat; nous nous trouvons face à une cinétique d’ordre zéro. Ceci implique que Vo est proportionnelle à la [E] Une phase d’équilibre: au cours de cette période, l’évolution de [S] est exponentielle décroissante et celle de P exponentiellement croissante.

B. Influence de la [S] sur la vitesse de RX enzymatique 1.Modèle de Michaelis et Mentin La RX enzymatique peut s’écrire schématiquement: Avec K1;K-1,K2 sont des constantes de vitesse. V = d[ES]/dt = K2 [ES] (1) d[ES]/dt = Apparition - Disparition » K1 [E][S] – (K-1 + K2)[ES] (2) De 1 et 2 on déduit que [ES] = [E] [S] = [E] [S] / Km + [S] avec Km la constante de Michaelis K1 K2 E + S ES E + P K-1 k2+k1/k-1+[S]

La relation fondamentale de la cinétique enzymatique Si on utilise une concentration illimitée de S par rapport à Enzyme, on peut considérer que ES = ENZ et que v = Vmax d’où on tire: La relation fondamentale de la cinétique enzymatique Représentation de la vitesse de la réaction en fonction [S] Selon le modèle de Mechaelis

Elle va de 10-6 mol/l pour les enzymes très actifs comme les peroxydases, à 10-2 mol/l pour les enzymes peu actives comme les enzymes protéolytiques. La connaissance de la Km d’une enzyme est importante car une enzyme à Km élevée ne pourra agir avec efficacité dans la cellule que si le substrat s’y trouve à concentration élevée.

2.La représentation de Lineweaver-Burk 1/v = f(1/[S]) Pente: Km/Vmax

C.Représentation de Eadie-Hofstee v = f(v/[S])

3. Facteurs affectant l’activité enzymatique La double spécificité enzymatique est intimement liée à la structure tridimensionnelle de l’enzyme. Toute modification de cette structure est susceptible d’avoir une répercussion sur l’activité enzymatique. modifications de la structure primaire modification liées à l’environnement Effet de la température B. Effet du pH C. Effecteurs chimiques: activateur et inhibiteurs

1. EFFET DE LA TEMPERATURE L'agitation thermique facilite le franchissement de la barrière d'énergie d'activation. D'où, lorsque la température augmente, la vitesse de réaction augmente. Mais lorsque la température est trop élevée, l'enzyme se dénature. La température optimale est souvent 37°C. Elle est supérieure pour les bactéries thermophiles.

2. Effet du pH Les enzymes sont très sensibles aux variations du pH et fonctionnent bien sur une gamme limitée du pH. Le pH peut agir sur plusieurs facteurs - l'ionisation des résidus de l’enzyme et du substrat et/ou du produit - la structure tertiaire des protéines et donc la stabilité de l'enzyme - la liaison du substrat à l'enzyme - l'activité catalytique de l'enzyme

VI. Conditions à respecter pour la détermination d’une activité enzymatique En règle générale, quand on désire effectuer la détermination quantitative d’une enzyme, on ne peut « doser » cette enzyme, mais on réalise la détermination de son activité en dosant les produits de la réaction enzymatique(ou en suivant la disparition de substrat). Les activités enzymatiques sont exprimés: L’unité internationale UI est la quantité d’enzyme qui transforme une micromole de substrat en une minute au conditions optimales de température et de pH. Le Katal (SI) est la quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par seconde. L’activité spécifique d’une enzyme est l’activité catalytique par unité de masse de protéine (I.U./mg d’enzyme solide). L’activité moléculaire représente le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d’enzyme.

Choix du substrat: spécifique( + affinité,+stable en solution, chromogène) pH de la réaction : pH optimum ( pas effet des constituants du tampon sur enzyme). Température de la réaction: on a souvent effectué des réactions enzymatiques à 37°C, mais des conventions internationales (en chimie clinique) préconisent une température de 30°C. Proportions entre enzyme et substrat, et durée de réaction : Rappelons que selon la relation de Michaelis, la vitesse de la réaction tend vers un Max quand la [S] est suffisamment élevée, et que dans ces conditions [ES]=[Et], Alors on peux écrire P / t = K2* Et donc P= K2*t*Et et si la durée est fixe: Autrement on doit opérer : à concentration saturante de substrat ([S]> 10Km) Et dans des conditions de vitesse constante: réaction d’ordre 0 pour cela il faut pour cela que la quantité des substrat transformé soit faible par rapport à la quantité initialement présente(<10%) et pendant une durée suffisamment courte( conditions de vitesse initiale) où la quantité de produit apparu est proportionnelle au temps. Phase pré analytique d’un prélèvement sanguin L’activité est mesurée le plus souvent pendant une durée de quelques minutes.les résultats sont rapportés à l’unité de temps: minute(UI) ou seconde (katal). P= Cte* Et

Il existe deux approches de base pour mesurer les activités enzymatiques: méthodes à temps fixe et les cinétiques Dosage par cinétique Cette approche consiste à suivre en continu la quantité du composé par les méthodes spectrométriques (colorimétrie, spectrophotométrie, fluorométrie, etc.), potentiométriques (pH, électrode à O2, etc.) et manométriques (production ou consommation de gaz comme O2 ou CO2). Il est donc beaucoup plus facile de s'assurer qu'on est bien dans la zone de V0.  Il est essentiel, pour les méthodes spectrométriques qu'un des substrats ou produits de la réaction aient des propriétés spectrales (visibles, UV ou IR) utilisables. C'est particulièrement le cas du NADP et du NADPH qui absorbent fortement dans le violet lointain.

Enregistrement continu de l’absorbance ou de l’intensité de fluorescence Le NAD(P)H a une forte absorption ( max 340 nm) et il est fluorescent NAD(P) n’a pas d’absorbance, ni fluorescence

Phosphatases 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP)

Glucose oxydase: électrode de Clark Polarographie: Mesure de la vitesse d’oxydation du glucose catalysée par la Glucose oxydase: électrode de Clark

Dosage à temps fixe Elle consiste essentiellement à mélanger les composantes de la réaction et à incuber durant un certain temps. à la fin de l'incubation ( de 30 min à 2 h), On y mesurera alors la quantité du substrat ou du produit voulu., puis, sachant la durée de l'incubation, déterminer la vitesse de la réaction. Le dosage du composé peut se faire par des méthodes spectroscopiques, radio-isotopiques ou autres. La principale faiblesse de cette approche est qu'elle ne permet pas de savoir avec certitude si on fait le prélèvement des échantillons à un point où on est toujours à V0.

Illustration de calcul d’activité enzymatique On dispose d'un extrait d’une Enzyme contenant 3 mg de protéines par ml et dans lequel I' enzyme est pure . La détermination d'activité dans les conditions optimales est réalisée par absorptiométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le produit P absorbe mais non le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les conditions de la mesure à 5 000 mol-1.L.cm-1 Son volume est de 3 ml. On utilise pour la détermination 100 μL d'extrait de E diluée au 500ème. On procède par méthode « 2 points » en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 uA Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E et l'activité spécifique.

Calcul de la concentration d'activité catalytique, B, en unités par ml d'extrait E: La variation d'absorbance est proportionnelle à la concentration en produit formé dans le milieu de lecture, c'est-à-dire le milieu réactionnel dilué par le réactif d'arrêt( V réactionnel + V réactif d’arrêt) L'activité catalytique présente dans le milieu de lecture était contenue initialement dans la prise d'essai d'enzyme V(prise enzyme). Activité catalytique B de l'extrait : Application numérique: B= 0.6 * 5 * 106*500 2 * 0.1* 5000 B = 1500 unités/ml d'extrait Activité spécifique de l’extrait Z sp: Z sp = 1500 UI/3mg = 500UI/mg de protéine (µmol de substrat hydrolysé/mn/mg de protéine ΔA * Vlec * 106 *dilution Δt * Venz * εl

V. Utilisation des enzymes comme réactifs: Dosage d’un substrat Grace à leur spécificité et à la rapidité de leur action, les enzymes constituants d’excellents réactifs pour doser un substrat dans biologiques. A .USAGE D’UNE ENZYME COMME REACTIF LIBBRE On procède en général à la détermination du produit de la réaction (mesure de son absorbance , ou emploi d’une réaction colorée) ou de la consommation de coenzyme nicotinique.

Méthodes en point final Quand la totalité du substrat est transformée (mesure de la différence d’absorbance entre la fin et le début de la réaction). Ceci est possible quand la réaction enzymatique est pratiquement irréversible: hydrolyse, phosphorylation par une kinase aux dépens de l’ATP par exemple. Cette méthode est choisi dans le cas doit se porter sur des enzymes à haute affinité pour le substrat à doser (Km faible).

METHODE CINETQUE On mesure la vitesse de la réaction pendant une durée fixe. Il faut se place dans des conditions de l’ordre 1 ceci est réalisé quand la concentration en substrat est faible devant Km (pratiquement inférieur à 0.2Km). la relation de Michaelis se simplifie alors en: v = Vmax * [S] / Km Entre les temps t1 et t2 la cinétique est non linéaire, mais peut être considéré comme linéaire si l’intervalle de temps est suffisamment court. On compare alors la vitesse de réaction pour l’échantillon à doser à celle observée avec un étalon de concentration voisine.les temps étant fixés, on est ramené à une comparaison des variations d’absorbance ΔE On a alors : C échantillon = ΔE échantillon * C étalon ΔE étalon

Dosage directe: exemple des lactates 260nm Longueur de lecture 340nm

Dosage indirecte du glucose par Glucose oxydase/peroxydase 4-aminophénazone peroxydase, quinone-imine Absorbable à 450nm Dosage indirecte du glucose par Glucose oxydase/peroxydase

B: USAGE D’UNE ENZYME COMME REACTIF IMMOBILISEE 1) Techniques immuno-enzymatique : test ELISA

2) Electrodes à enzyme: Les biocapteurs On recouvre la membrane de l’électrode à pO2 (électrode de Clark) d’un film protéique contenant la glucose oxydase, l’électrode va mesurer l’oxygène consommé lors de la réaction de la glucose oxydase: Par ampérométrie cette électrode va permet de dosage du glucose.

3) Chimie sèche Les bandelettes réactives: ces bandes sont imprégnés par des enzymes Intérêts: le dépistage et le suivi de certaine maladie (diabète).

VI. Applications Le dosage des différents substrats par voie enzymatiques trouve tout son intérêt dans la pratique courante. Il est d’ailleurs la méthode de référence de pas de substrat; comme c’est le cas du glucose dont le dosage par héxokinase/glucose 6 phosphate déshydrogénase est la méthode de référence. La recherche de augmentation de l’activité de certaines enzymes dans des circonstances pathologique: un support de diagnostic et un outil de surveillance: La cytolyse hépatique ( ALAT,ASAT, OCT,LDH) . L’hépatite virale: ALAT, ASAT, phosphatase alcaline, leucine aminopeptidase Le cholecstase ( phosphatases alcalines, gamma GT, 5’nucleotidase) La pancréatite aigue hémorragique (amylase, lipase) L’infarctus de myocarde LDH, ASAT et (CPKMB) qui 'est un indice cinétique de l’infarctus (oriente la prise en charge). l’activité enzymatique est recherché dans le déficit enzymatique congénitale (oligophrénie phénylpyruvique conséquence du déficit en phénylalanine hydroxylase) sujet de dépistage néonatale; ou acquis par intoxication(diminution de l’activité par inhibition de l’acétylcholine estérase par les pesticides ou les gaz de combat)

CONCLUSION La proportionnalité entre la vitesse initiale de la réaction enzymatique et la concentration en enzyme est très importante, car elle permet le dosage une enzyme dans un milieu biologique quelconque. En pratique, on utilise les conditions expérimentales pour lesquelles l’enzyme présente l’activité catalytique la plus courte(conditions optimales de T° et de pH) et surtout une concentration initiale en substrat très élevée par rapport à la concentration enzymatique présumée. La détermination des substrats par voie enzymatique a donné un grande pousse en matière de sensibilité et de spécificité, mais aussi une facilité d’usage et automatisation des tests. La technologie des enzymes immobilisées a donné un champs prometteur en matière thérapeutique: correction des déficits enzymatiques, détoxification par enzymes microsomales.