Automatisation de l'Hémogramme NFS

CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE L’HEMOGRAMME englobe: -les numérations des éléments figurés -le dosage de l’Hémoglobine -la mesure de l’Hématocrite -le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires -l’établissement de la formule leucocytaire Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de Na), éventuellement sang capillaire L’Hémogramme est automatisé complètement ou partiellement dans les laboratoires

Numérations: GR, GB, Plaquettes. Valeurs et constantes: érythrocytaires: -Taux Hémoglobine sanguin Hb -Hématocrite Ht -Volume Globulaire Moyen VGM -Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH -Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH -Indice de Distribution des Rouges IDR plaquettaires: -Thrombocrite THT -Volume Plaquettaire Moyen VPM Indice de Distribution Plaquettaire IDP

leucocytaire: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de leucocytes: PN, PE,PB,L,M -FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée -FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés) Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques

  Anciennes unités Facteur x Unités internationales Globules rouges 106 par mm3 106 T/L (téra, 1012) Hémoglobine g/100 ml 0,621 mmol/L Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L VGM µ3 F/L (femto,10-15) TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15) CCMH % ou g/100ml Globules blancs 103 par mm3 G/L (giga, 109) Plaquettes

GR Homme 4,5 à 6 .106 /mm3 Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm3 Hématocrite Homme 40 à 54 % Femme 37 à 47 % Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml Femme 12 à 16 g/100ml VGM 82 à 98 fl CCMH 32 à 36 % TCMH > 27 pg IDR <15 % Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3 GB 5000 à 10 000 /mm3 Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3 Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3 Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3 Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3 Monocyte 200 à 800 /mm3

Granulocyte neutrophile Polynucléose neutrophile Défaut Paramètres Excès Erythropénie GR Polyglobulie Hemodilution Hématocrite Hemoconcentration Anémie Hémoglobine Microcytose VGM (Normocytose) Macrocytose Hypochromie CCMH* TCMH (Normochromie) IDR Anisocytose Thrombopénie Plaquettes HyperThrombocytose Leucopénie GB Hyperleucocytose Neutropénie Granulocyte neutrophile Polynucléose neutrophile Granulocyte éosinophile Hyperéosinophilie Granulocyte basophile Basocytose Lymphopénie Lymphocyte Hyperlymphocytose Monocytopénie Monocyte Monocytose *La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie

Pentra 60 Horiba-ABX Sysmex XT Pentra 120 Retic Horiba-ABX ACT 5DIFF Beckman Coulter CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories Coulter HMX Beckman Coulter CELL-DYN SMS Abbot Laboratories

LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

Deux principes très différents: LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT Deux principes très différents: La Variation d’impédance Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue. Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire approchée. La mesure optique Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977): -focalisation hydrodynamique -diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL, cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA 120, Sysmex automate XT2000)

Numération des Globules Rouges Les paramètres calculés L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width) L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose. Double population 50 100 200 IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 % Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10 TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine. TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10 CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine. CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000

Numération des Plaquettes Histogramme des PLT et paramètres calculés Le Thrombocrite TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000 L'IDP ou PDW Indice de distribution plaquettaire CV % sur la distribution volumétrique des PLT= coefficient d’anisocytose plaquettaire VMP Grandes Plaquettes > 20 fl Petites plaquettes, débris ? < 2 fl

LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatisée TROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff) La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume. Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…)

Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate: FL du nouveau-né Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF antérieures Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur les graphes

(CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter ») Formule Leucocytaire 5 populations Analyse automatisée individuelle des caractéristiques cellulaires naturelles ou modifiées d’un seul leucocyte  PERFORMANCE Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à 10000):  PRECISION de la FL automatisée par rapport à FL microscopique Circulation des GB , après hémolyse des GR, individuellement, séparés, dans un système liquide de flux laminaire: Focalisation Hydrodynamique ou gainage cellulaire, principe de base de la technologie de CytoMétrie en Flux (CMF) Apparition successive des GB indivualisés dans un ensemble de mesure, permettant une analyse optique simultanée de plusieurs paramètres naturels (volume cellulaire, présence de granulation, hétérogénéité du noyau) ou modifiés (coloration, fluorescence) de la cellule. (CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter »)

Formule 5 Populations : critères de reconnaissance Les automates associent divers principes technologiques permettant l’accès à divers critères de reconnaissance Variation Impédance (= Volume cellulaire) Principe Coulter pour le volume, ou mesure optique pour la taille Diffraction lumineuse (= taille cellulaire et Granularité) Diffraction de la lumière par la cellule (différents angles) Cytochimie sélective Coloration d’un élément de la cellule, par simple affinité (ex:coloration des granulations éosinophiles) ou par activité enzymatique chromogène sélective (ex: peroxydase des granulations) Conductivité (opacité) Courant Radio Haute Fréquence (RF) Structure de la cellule par un conduction courant haute fréquence Cytolyse Lyse sélective de populations. Ex: tous les GB sauf PB. (évidemment dans tous les cas de FL complète automatisée, la lyse de GR est obligatoire

Détermination de la formule 5 populations Chaque société sur ses automates combine plusieurs technologies et donc plusieurs critères de reconnaissance Impédance + Conductivité HF + Diffraction lumineuse BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750 Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique) BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3 Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.) HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120 BayerDiagnostics Automates Advia70 BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff Diffraction lumineuse + Cytochimie (Eosino) + Cytolyse Sysmex SF3000, XE2100 Diffraction lumineuse multi-angulaire sans cytolyse AbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700, 4000

Exemple d’hémogramme complet sur Pentra Horiba ABX

Exemple d’hémogramme complet sur Beckman Coulter HmX

Réticulocytes Nouveau bleu de méthylène

LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES Exemple sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX Marquage fluorescent des ARN résiduels Fluorochrome: Thiazole orange Focalisation dans cellule de mesure, d’une dilution sanguine 1/3000 dans diluant isotonique + thiazole orange 2 informations recueillies: - comptage et volume par impédance (saphir) - signal d’intensité de fluorescence OFL émise à 530 nm, déclenché par excitation transitoire, recueillie à 90° du trajet optique

Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX Réticulocytes à fluorescence élevée OFL Intensité Fluorescence Réticulocytes à fluorescence moyenne Réticulocytes à fluorescence faible GR matures Volume

PATHOLOGIE LEUCOCYTAIRE I - Polynucléoses neutrophiles Definition: => neutrophiles >7-8000/mm3 Variations physiologiques:  3) Cancers et hémopathies: grossesse, menstruations métastases intramedullaires =>polynucléose+++ avec myélemie effort physique, digestion, stress +++ Nouveau-né Leucémie myéloide chronique Etiologies: 4) Nécroses tissulaires: - infarctus... 1) Infections Bactériennes: 5) Régénération médullaire intense état fébrile, splénomégalie, HC+ 6) Tabagisme+++ infections généralisées: 7) Prises médicamenteuses: septicemies Corticoides et Adrenaline endocardites lithium, héparine infections focalisées: qqs toxiques hémolysants ( Plomb, benzène) abces cutané infections dentaires+++, ORL++ 8) Maladies Métaboliques: infections profondes: gyneco....... Insuffisance rénale 2) Maladies Inflammatoires: acidose diabétique artérites: Horton, PAN Cushing rhumatismales: PR, myosite goutte

II - Myélémies Definition: présence dans le sang d'éléments immatures de la lignée granuleuse myélémie pure ou associée à une érythoblastémie 3- Un syndrome myéloprolifératif: leucémie myéloide chronique leucémie myélo-monocytaire chronique thrombocythémie essentielle polyglobulie rarement 4- Une myélofibrose: splénomégalie myéloide: splénoM + erythroblastémie++ myélofibrose aigue primitive myélofibrose II à un envahissement médullaire (sans PNose): LA lymphoblastique type L3 myélodysplasie Hodgkin, Lymphome cancers tuberculose Etiologies: 1- Réactionnelles: (< 10 %) sepsis sévère tuberculose aigue syndrome inflammatoire 2- Régénératives: hémorragie aigue hémolyse sortie d'aplasie, agranulocytose corticothérapie facteur de croissance

III - Hyperéosinophilies Definition: Eosinophiles >350-500-800/mm3 sur pls examens successifs Etiologies: 1) Parasitoses: parasites à migration tissulaire=> l'Eosinophile joue un role dans les défenses contre le parasite: Eosinophilie fluctuante en coup d'archer. Quelle parasitose? Europe: ascaris, taenia, distomatose, oxyurose, larva migrans, hydatidose Antilles: bilharziose, anguillulose, ankylostomose Afrique: filariose, loase, onchocercose

III - Hyperéosinophilies 2) Allergiques: car les enzymes du P.Eosinophile limitent la réaction anaphyllactique terrain atopique personnel ou familial: asthme, rhinite, conjonctivite... cutané: urticaire, eczéma alimentaire... vascularite allergique medicaments : penicillines, sulfamides , protéines injectables (extrait de foie) vaccins , produit de contraste iodé 3) Cancers et Hemopathies: Hodgkin LMC à forme hyperEo LAM2 Eo LAI Lymphomes malins (sécrétion ESF) cancers à nécrose tumorale

III - Hyperéosinophilies 4) Collagenoses vascularites : Périartérite noueuse, LED, angéites allergiques (Churg-Strauss,Wegener.......) LED, dermatopolymyosite, PR fasciites à éosinophiles (Shulman) sarcoïdose, oedème angioneurotique  5) Dermatoses prurigineuses parasitose (gales) pemphigus, dermatite herpétiforme toxidermie 6) Causes diverses irradiation brûlure splénectomie pancréatite aigue

Sd d'HyperEosinophilie Essentielle definition: Eosinophilie > 1500/mm3 pendant > 6 mois idiopathique   risque à complications multiviscérales graves liées à la toxicité des Eo dans les tissus pulmonaire neurologique (neuropathie périphérique) myosite et fasciite cardiaque (Endocardite de Loëffler)

IV - Lymphocytoses isolées Définition : lymphocytes > 4000/mm3 chez l’adulte > 6000/mm3 chez l’enfant > 11000/mm3 chez le NNé Eliminer: 1- les fausses  hyperlymphocytoses "inversion de formule " 2 - les lymphocytes anormaux leucoblastes cellules de Sezary cellules lymphomateuses tricholeucocytes sd MNI

Lymphocytoses isolées Diagnostic étiologique: se discute selon l'âge à chez l'enfant :à BENIGNES Viroses : oreillons, rougeole, rubéole, varicelle, HV Coqueluche Hyperlymphocytose bénigne de CARL-SMITH Post-vaccinale, ou réaction immuno-allergique médicamenteuse. à chez l'adulte : Rarement bénin aigues : Infections brucellose, typhoïde Chroniques: allergies médicamenteuses , insuffisance surrénalienne, hypophysaire, Addison thyréotoxicose , asplénie fonctionnelle , maladies auto-immunes , tabac (F age moyen, HLADR7, Lympho binucléés) à trés souvent: Hémopathies malignes+++ leucémie lymphoide chronique Waldenström lymphome malin leucémisé :

V- Syndromes mononucléosiques Définition : présence dans le sang de grandes cellules mononucléées: grands lymphocytes activés hyperbasophiles +++ = lymphocytes T cytotoxiques contre des: cellules infectées (Virus, Bactéries, Parasites) cellules étrangères (Reaction de rejet) Ag étrangers (penicilline) Ex. : MNI : les lymphocytes B sont infectés par EBV puis lysés par les T cytotoxiques activés Diagnostic + : reconnaître le sd mononucléosique sur NFS - grands lymphocytes bleutés +++  5 à 90 % , +/- hyperlymphocytose 10 à 25000/mm3 GR et plaquettes normaux Diagnostic différentiel : sur la NFS : présence de lymphoblastes (LAL) grands lymphocytes non basophiles

Quelle est sa cause? 1) Causes infectieuses : Virales Parasitaires * MNI (EBV): 85 % des sd mononucléosiques: fièvre + asthénie + angine + rash Dg : MNI test+ Paul Bunnel + IgM EBV * CMV : 5 % asymptomatiques post-transfusionnel *primo-infestation HIV Parasitaires * Toxoplasmose : < 1 % (contact avec des chats ou viande mal cuite) adénopathies cervicales +++ sans angine * paludisme Autres causes infectieuses: Viroses diverses: (HVB, HSV, HIV, rubéole, VZV, rougeole, oreillons...) infections à germes intracellulaires à Rickettsiose, brucellose,  typhoïde, syphilis 2) R. immunologiques: immuno-allergiques (péni,sulfamides) greffes maladies autoimmunes : LED