Laboratoire d’Histopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001 Master "Ingénierie pour la Santé" Option "Ingénierie Médicale" Culture de cellules animales Sophie PINEL Laboratoire d’Histopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001 Faculté de Médecine, Bât D 1er étage 9 avenue de la Forêt de Haye 54505 VANDIEUVRE LES NANCY Tél : 03.83.68.32.04. Email : pinel.sophie@tiscali.fr

Fractions cellulaires isolées INTRODUCTION GENERALE Modèles d’études en biologie animale (≠ biologie végétale) COMPLEXITE + - Organisme entier Homme Animal Relations intersystèmes Organe isolé Environnement artificiel pour croissance et/ou fonction Cellules en culture Liens intercellulaires normaux rompus Homogénéité Fractions cellulaires isolées (Fractions subcellulaires, macromolécules)

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1. DIFFERENTS TYPES DE CULTURES CELLULAIRES 1.1. Méthodes d’obtention des cellules cultivées  Achat auprès d’un organisme certifié American Type Culture Collection (ATCC) European Collection of Cell Cultures (ECACC) Monoclonal avec caractéristiques définies, qualité contrôlée mais onéreux  Echanges entre laboratoires Qualité non garantie : risques de contamination ++  Isolement à partir d’un liquide ou d’un tissu biologique

Suspension cellulaire CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.2. Cultures primaires – Cultures secondaires 1.2.1. Cultures primaires Isolement à partir d’un liquide biologique Cellules circulantes Sang : lymphocytes, cellules leucémiques Liquide pleural, liquide d’ascite : cellules tumorales Centrifugation sur gradient de densité, ou trieur de cellule Isolement à partir d’un organe ou d’un tissu Cellules adhérentes Culture d’explants Après quelques jours Fragment d’organe/de tissu Milieu de culture adapté Dissociation mécanique et enzymatique Action mécanique (broyer, émincer) Action d’enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase) Suspension cellulaire Mise en culture Plusieurs types cellulaires (fibroblastes dominants) Purifier pour système monoclonal Méthodes de clonage Méthodes de séparation physique (centrifugation sur gradient de densité, chromatographie d’affinité, cytométrie de flux, électrophorèse, séparation par billes magnétiques) 1.2.2. Cultures secondaires Cultures établies par repiquage successifs de cellules déjà mises en culture (cultures primaires ou secondaires, cellules achetées, …)

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.3. Cultures finies – Cultures continues 1.3.1. Cultures finies Cultures cellulaires à durée de vie limitée Après X repiquages (env. 30 à 60 mitoses/divisions), division cellulaire stoppée, mort cellulaire par apoptose Cellules somatiques issues de tissus normaux 1.3.2. Cultures continues Cellules en cultures capables de se diviser indéfiniment Cellules ayant des propriétés d’IMMORTALITE Immortalité innée : cellules souches Immortalité acquise : CELLULES TRANSFORMEES = cellules tumorales Cultures primaires puis secondaires à partir d’une tumeur animale ou humaine Cultures primaires puis secondaires à partir d’un tissu normal : transformation in vitro (agents chimiques, radiations, virus) (+) : Culture illimitée dans le temps, manipulation plus facile et croissance plus rapide ( -) : instabilité génomique, pertes des propriétés morphologiques et fonctionnelles initiales

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension 1.4.1. Cellules adhérentes Dépendance vis-à-vis de l’ancrage = Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre Cellules issues de tissus normaux, la plupart des cellules issues de tumeurs solides. Cultures en monocouche Ensemencement dans des boîtes de culture : les cellules adhèrent au fond, puis se divisent, se placent les une à côté des autres jusqu’à former un tapis cellulaire. Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits Cultures tridimentionnelles = sphéroïdes Cellules mises en culture en suspension dans le milieu et maintenues sous agitation lente afin de favoriser l’accrochage des cellules entre elles: formation d’amas sphériques au sein desquels les cellules se divisent Spinner

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension (suite) 1.4.2. Cellules en suspension Indépendance vis-à-vis de l’ancrage Ex : Cellules issues du sang, cellules leucémiques Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation) et se multiplient ainsi Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits Remarque : Récipients en verre Récipients en plastique +/- pré-traitement Systèmes matriciels simulant la matrice extracellulaire

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.5. Types cellulaires cultivés Identification par rapport au système dont les cellules dérivent Caractéristiques morphologiques Caractéristiques fonctionnelles +/- conservées Rque : Influence des conditions de culture Cellules de type lymphoblastique En suspension, forme sphérique Cellules de type épithélial Ancrage indispensable, polygonales, et aplaties, très serrées Cellules de type fibroblastique Ancrage indispensable, allongées et bipolaires, filaments Cellules de type endothélial Ancrage indispensable, polygonales, petite taille Cellules de type neuronal Ancrage indispensable, un corps central et départ de dendrites

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.5. Types cellulaires cultivés (suite) Hybridomes Cellules hybrides obtenues par fusion de deux cellules appartenant à des types différents mais apparentés Intérêt : Combiner les propriétés des 2 types cellulaires Ex : Lymphocyte issu de la rate capable de produire un anticorps défini + Cellules de myélome se divisant très rapidement et possédant la machinerie pour produire des anticorps mais l’utilisant pas = Hybridome capable de produire un très grande quantité de l’anticorps désiré Intérêt industriel, diagnostique et clinique

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 2. CROISSANCE DES CELLULES EN CULTURE IN VITRO 2.1. Le repiquage des cultures cellulaires Lavage du tapis cellulaire (PBS) Détachement des cellules par action enzymatique (trypsine, collagénase à 4° ou à 37°C) 2.2. Les différentes phases de la croissance 1 : phase de latence, 2 : phase de croissance exponentielle, 3 : phase de ralentissement, 4 : phase stationnaire, 5 : phase de déclin.

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 2.3. Cryoconservation des cellules Cellules peuvent être congelées Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la population cellulaire Permet d’interrompre l’activité Cryoconservateur : DMSO, glycérol Azote liquide Descente progressive en température

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3. CONDITIONS ET DIFFICULTES DE LA CULTURE CELLULAIRE 3.1. Eviter les contaminations 3.1.1. Contaminations chimiques Endotoxines, résidus plastiques, ions métalliques, traces d’agents nettoyants/désinfectants, etc… Effets invisibles, produits difficiles à détecter 3.1.2. Contaminations biologiques Levures, bactéries, champignons Modification du pH et de la turbidité du milieu Effets généralement visibles, facile à détecter Virus, mycoplasme Effets invisibles, détection possible par analyse spécifique Détection de mycoplasme : marquage de l’ADN des cellules avec du Hoechst Négatif Positif

HOTTE A FLUX LAMINAIRE VERTICAL POSTE DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3.1.3. Moyens de lutte contre les contaminations Environnement et surfaces propres Consommable utilisé adapté (fournisseur certifié) Equipement, récipients plastiques et verre propres et stérilisés Milieux de culture stériles Usage d’antibiotiques, d’antifongiques Maintenir la stérilité des cultures et des milieux HOTTE A FLUX LAMINAIRE VERTICAL ou POSTE DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE Filtre HEPA (high efficiency particule air) Protection des cultures, milieux, plastiques Protection de l’environnement Protection du manipulateur (vitre à l’avant)) Lampe UV Air ambiant Air contaminé Air stérile

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3.2. Trouver les conditions de culture optimales 3.2.1. Critères de jugement les cellules ne meurent pas obligatoires les cellules se divisent Environnement optimal les cellules reproduisent in vitro les fonctions physiologiques ou biochimiques connues in vivo Les critères d’évaluation Viabilité cellulaire Microscope en phase inversée, bleu trypan, numération à l’hémocytomètre Taux de croissance Morphologie Efficacité d’ensemencement (dilution de la culture et formation de colonie) Expression de fonctions spécifiques

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3.2. Trouver les conditions de culture optimales (suite) 3.2.2. Paramètres de l’environnement à contrôler Le milieu de culture Milieux complexes qui doivent apporter tous les éléments nutritifs nécessaires à la croissance/prolifération des cellules animales Eau Ions minéraux nombreux et variés en concentration adéquate (Na+, K+, Cl-,HCO3-, H2PO42-) Source de carbone et d’énergie : le plus souvent glucose Eléments de constitution : acide aminés essentiels +/- non essentiels, + glutamine acides gras, cholestérol, vitamines + cofacteurs, riboses et désoxyribose Facteurs de croissances divers (FGF, EGF, PDGF, IL-2, etc…) Sérum de veau fœtal (1,5 à 10%) décomplémenté Antibiotiques +/- antifongiques : pénicilline G, streptomycine, +/- amphotéricine B GAZ : O2 et CO2 Les paramètres physico-chimiques Osmolarité avoisinant celle du sérum physiologique (300 mOsm/L) Rôle des ions, contrôle les mouvements d’eau et de substances entre milieux extra et intra-cellulaire pH compris entre 7,0 et 7,4 En particulier HCO3-/CO2, système tampon Température : 37°C Hygrométrie : 80% d’humidité Eviter évaporation du milieu Contrôle de la température, hygrométrie, 5% de CO2 INCUBATEUR A CO2

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 4. DOMAINES D’APPLICATION Culture cellulaire = Outil majeur en biologie animale 4.1. Modèle d’étude Etude des propriétés biologiques et biochimiques des cellules Etude des liens entre les causes d’une maladie/anomalie et ses répercussions sur la cellule Etude des effets d’un agent chimique sur les cellules Etude du processus de vieillissement cellulaire +/- comment interagir Etude nutritionnelle 4.2. Support aux tests de toxicité Etude des conséquences toxiques d’un nouvel agents chimiques, cosmétiques, pharmaceutiques Cellules hépatiques et rénales En aval des essais chez les animaux 4.3. Recherche en cancérologie Différence entre cellules normales et tumorales Etude des agents transformants = cancérigènes Screening de nouveaux médicaments anticancéreux

CULTURE DE CELLULES ANIMALES 4.4. Virologie Etude de la réplication et des propriétés des virus . Etude des mécanismes d’infection par les virus Etude de l’efficacité des antiviraux 4.5. Applications industrielles Production d’anticorps monoclonaux (diagnostic, clinique, recherche) Production de protéines de synthèse (insuline, facteur de croissance) Production de virus en grande quantité pour préparation des vaccins 4.6. Etudes génétiques Analyses diagnostiques sur le caryotype, les chromosomes, l’ADN 4.7. Génie génétique, thérapie cellulaire et thérapie génique Introduction de gènes dans les cellules pour en modifier les propriétés d’expression (recherche, application clinique ?) Production de tissus de substitution : thérapie cellulaire (cornée, peau) +/- essais !!! Réintroduction de gènes fonctionnels dans les cellules à visée thérapeutique