Etude du métabolisme cérébral chez le primate 9ème Journées Jeunes Chercheurs / Imagerie Etude du métabolisme cérébral chez le primate par spectroscopie RMN : application au modèle 3-NP de la maladie de Huntington Fawzi Boumezbeur CEA - SHFJ Orsay, France

La Résonance Magnétique Nucléaire en bref Introduction La Résonance Magnétique Nucléaire en bref B0 Spins nucléaires Signal de précession libre Transformée de Fourier raie spectrale pixel dans une image Excitation radiofréquence

Que mesure la Spectroscopie RMN ? Introduction Que mesure la Spectroscopie RMN ? Imagerie RMN = détection des 1H de l’eau cérébrale Spectroscopie RMN = détection des autres molécules 1H de l’eau 1H de métabolites

Introduction L’environnement technique de la RMN Hardware Informatique Aimant 3 Tesla, corps entier avec gradients et shims performants Informatique Electronique 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 tCho tCr Glu NAA ppm Programmation de séquence Sondes radiofréquences Traitement des spectres Traitement des images Mais aussi : du matériel de stimulation, de monitorage, etc…

Introduction Etude du métabolisme par spectroscopie RMN Non invasif , analyse biochimique , détermination des concentrations de métabolites et des vitesses de réactions biochimiques in vivo. Concentrations des métabolites Vitesses de réactions biochimiques

Introduction Plan Quantification des concentrations de métabolites cérébraux Détermination des vitesses de réactions biochimiques Corrélation avec la 18FDG-TEP Application à l’étude de la maladie de Huntington

Concentration des métabolites Spectroscopie localisée à TE court Voxel striatal (3.9 mL) centré sur le striatum: 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 Spectre 1H (PRESS) Segmentation automatique Liquide céphalo-rachidien Matière grise / blanche

Concentration des métabolites Analyse par combinaison linéaire de spectres 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 Spectre = combinaison linéaire des spectres de chaque métabolite. En raison de la superposition des pics en spectroscopie du 1H, un logiciel se charge de déconvoluer les différentes contributions à partir d’une base de spectres. Glutamate NAA Créatine Choline Glutamine GABA Ins Asp NAAG Tau Lac  Quantification relative d’une huitaine de métaboliltes.  Quantification absolue par rapport à la concentration d’eau prise comme référence interne

 précurseur = U-13C glucose. Vitesses de réactions biochimiques Marquage isotopique au 13C 13C isotope stable du carbone, détectable en RMN (contrairement au 12C) faible abondance naturelle : 1,1 % Pyr/Lac Cycle de Krebs Glucose  précurseur = U-13C glucose. CG Glutamate Glutamine U-13C 13C3 Incorporation du 13C du glucose dans les différents intermédiaires de la glycolyse puis du cycle de Krebs. VKrebs Since this pioneer study, major metabolic rates have been measured in the animal and in the human brain using 13C labeled glucose. VTCA, VX and Vcycle 13C4 13C4 VX 13C3 Vcycle 13C3  Détection par spectroscopie RMN des cinétiques d’enrichissement 13C du glutamate sur les carbones C4 (1er tour) et C3 (2nd tour) .

Vitesses de réactions biochimiques Estimation de VKrebs Cinétique d’incorporation du 13C dans le pool de glutamate* VKrebs(1) VKrebs VKrebs(4) VKrebs(3) VKrebs(2) signal 13C (Glu*) Temps d’infusion • Modèle mathématique : conservation de la masse et du 13C  équations différentielles couplées résolues numériquement pour une valeur donnée de VKrebs  Glu*(t) • Itération de VKrebs pour minimiser la différence modèle/points expérimentaux

Vitesses de réactions biochimiques Détection directe ou indirecte du 13C ? Comparaison de sensibilité pour du [2-13C]ethanol à 4.7T 13C1H3-CH2OH Detection directe 13C Detection indirecte 1H-{13C} durée d’acquisition = 17.5 min durée d’acquisition = 2.1 min  gain de sensibilité d’un facteur 5 à 10 [Novotny et al., MRM 1990]

Accroissement des raies-satellites Diminution de la raie-mère Vitesses de réactions biochimiques Détection indirecte 1H-{13C} Couplage hétéronucléaire JCH Comme des dipôles magnétiques, les spins nucléaires 1H et 13C interagissent. Ce couplage dipôle-dipôle se manifeste par une démultiplication des raies : JCH Raie 1H-12C Raies 1H-13C Lorsque un métabolite s’enrichit en 13C : Accroissement des raies-satellites T T0 Diminution de la raie-mère

Vitesses de réactions biochimiques Détection des 1H Glu13C4 et Glu13C3 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 Glu-H3 Glu-H4 Conditions : Stabilité du signal et de l’animal Spectre de base PRESS : Spectres de difference : (base - spectres dynamiques) 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

Vitesses de réactions biochimiques Analyse des spectres de différence Détection simultanée apparition des raies 1H-13C (en négatif) diminution des raies 1H-12C (en positif) e b c d a Spectre de différence Résultat de l’analyse Résidus de l’analyse Profil correspondant à l’incorporation de 13C en position C4 du glutamate Profil correspondant à l’incorporation de 13C en position C3 du glutamate

Vitesses de réactions biochimiques Mesure de VKrebs dans le cerveau de macaque Glutamate 13C (en mM) temps d’infusion (en min) Glu C4 Glu C3  macaques contrôle : VKrebs = 0.55 ± 0.04 mol.g-1.min-1 (n=4)

Corrélation avec la TEP La 18FDG-TEP en bref 18FD Glucose CMRglc = vitesse de consommation cérébrale de glucose = métabolisme glycolytique CMRglc 18FD Glucose-6-P Pyr/Lac VKrebs = métabolisme oxydatif VKrebs Cycle de Krebs KG Glutamate Glutamine VX Vcycle

Mesure de CMRglc dans le cerveau de macaque par 18FDG-TEP Corrélation avec la TEP Mesure de CMRglc dans le cerveau de macaque par 18FDG-TEP Radioactivité du 18FDG (en kBq/mL) temps d’infusion (en min) activité totale 18F contribution du 18FDG-6-P contribution du 18FDG Recalage IRM/18FDG-TEP macaques contrôle : CMRglc = 0.24 ± 0.01 mol.g-1.min-1 (n=2) D’où un ratio CMRglc/VKrebs = 0.44

Application à la maladie de Huntington La maladie de Huntington (MH) Sujet sain Malade Images Gwenaëlle Douaud CEA-SHFJ Maladie génétique Huntingtine mutée Ht Vulnérabilité des neurones striataux Atrophie du striatum Objectifs : Exploration des altérations du métabolisme cérébral Objectif double : compréhension des mécanismes biochimiques impliqués dans le dysfonctionnements ou dans l’activation cérébrale Outil d’évaluation de stratégies thérapeutiques ds le contexte des pathologie neurodégé Diagnostique précoce Développement pharmacologique sur modèle animal Suivi thérapeutique chez l’homme

Application à la maladie de Huntington Le modèle primate de la MH Modèle d’intoxication à l’acide 3-NP H+ Acétyl CoA Glucose ATP ADP 3-NP inhibition Cycle de Krebs SDH NAD NADH Mitochondrie L'expression mesure des flux métaboliques désigne la mesure... Depuis une quinzaine d'années, la RMN a notamment permis d'étudier... Cette dernière mesure présente un intérêt majeur dans la mesure où le cycle de Krebs est étroitement lié à la synthèse d ’énergie sous forme d’ATP. En effet, la dégradation des carbohydrates et des acides gras opérée par le C de K génère un gradient protonique à travers la membrane mitochondriale. Gradient qui constitue la FEM nécessaire à la synthèse d’ATP. Ainsi, la mesure de la vitesse du cycle de Krebs renseigne directement sur l’état énergétique du tissu étudié, et éventuellement sur l'altération du métabolisme énergétique en conditions pathologiques. H+ Le cycle de Krebs = synthèse oxydative d’ATP Modèle de neurodégénérescence sélective du striatum

Application à la maladie de Huntington Protocole Macaques (macaca fascicularis, poids ~7kg, n=4) 22 Semaines d’intoxication chronique au 3-NP (~25 mg/kg/jour) Anesthésie au propofol i.v. et ventilation Monitorage Maglife (ECG , PNI, PO2, capno) Objectifs Suivi longitudinal des altérations métaboliques accompagnant la dégénérescence : quantification absolue des métabolites mesure du métabolisme oxydatif VKrebs par spectroscopie RMN du glucose marqué au 13C corrélation avec la mesure du métabolisme glycolytique CMRglc par 18FDG-TEP et les données morphométriques.

À partir de 2004 : Sujets sains et patients MH symptomatiques Conclusion Du développement méthodologique à la recherche clinique 1997-2001 : Rats sains et intoxication 3-NP aigüe et chronique Diminution de VKrebs de 18% 2001-2004 : Macaques sains et intoxication 3-NP chronique G. Douaud CEA-SHFJ P. Brugière CHU Mondort Créteil À partir de 2004 : Sujets sains et patients MH symptomatiques

Conclusion Perspectives Mais aussi : Suivi des primates au long de l’intoxication chronique au 3-NP et exploitation des résultats. Passage à l’homme avec des sujets sains puis des malades en collaboration avec l’Hopital Henri Mondort (Créteil) Suivi thérapeutique sur des patients greffés. Mais aussi : Etude des métabolismes oxydatif (VKrebs) et glycolytique (CMRglc) pendant l’activation cérébral. Combinaison avec la spectroscopie 31P pour l’étude du couplage mitochondrial synthèse d’ATP/cycle de Krebs. Combinaison avec la spectroscopie de diffusion pour suivre la compartimentation des métabolites.

Remerciements Vincent Lebon Laurent Besret Julien Valette Françoise Vaufrey Eric Giacomini Velislav Slavov Gwenaëlle Douaud Pierre Brugière Emmanuel Brouillet Pierre-Gilles Henry Philippe Hantraye Gilles Bloch Jacques Bittoun