Résumé Une altération de l’ADN entraine une translocation de p53 dans le noyau. Cette translocation a lieu grâce au complexe dynéine/dynactine via le réseau de microtubules. Les 25 premiers acides aminés de la protéine p53 sont indispensables à sa fixation sur les microtubules

Nature cell biology vol 2 october 2000 p53 is associated with cellular microtubules and is transported to the nucleus by dynein Paraskevi Giannakakou, Dan L. Sackett, Yvona Ward, Kevin R. Webster, Mikhail V. Blagosklonny and Tito Fojo Nature cell biology vol 2 october 2000 ALLAIN Vincent KEITA Batiecoro

Contrôle du cycle cellulaire Recombinaison et Réparation de l’ADN Rôle de p53 Apoptose Contrôle du cycle cellulaire p53 Dommage de l’ADN Recombinaison et Réparation de l’ADN

Activité indépendante Arrêt du cycle cellulaire Rôle de p53 Dommage de l’ADN Rétrocontrôle négatif MDM2 Activation de p53 Activité indépendante de la transcription: via la mitochondrie, … Répression transcriptionnelle Activation transcriptionnelle bcl-2, fgf1 bax, noxa, puma, fas... p21, GADD45, 14-3-3s mdm2 Arrêt du cycle cellulaire Apoptose

p53 et les cancers 50 % des cancers humains sont dus à une inactivation de p53 par des mutations sur ce gène Ces mutations entrainent une perte des capacités anti-prolifératives et apoptotiques de p53 - Il existe d’autres mécanismes entrainant l’inactivation de p53 - L’un des mécanismes les moins connus est la séquestration de p53 dans le cytoplasme

Problématique Comment la protéine p53 active est-elle transloquée dans le noyau lorsque l’ADN subi des dommages? - Rôle des microtubules - Rôle de la dynéine

Tubuline et microtubules

Etude de l’interaction de p53 avec la tubuline p53 sous sa forme sauvage ou mutante interagit spécifiquement avec la tubuline in vivo

Etude de l’interaction de p53 avec les microtubules p53 sous sa forme sauvage ou mutante interagit spécifiquement et préférentiellement avec les microtubules

Etude de l’interaction de p53 avec les microtubules p53 sous sa forme sauvage ou mutante s ’associe préférentiellement avec les microtubules qu’avec les sous unités de la tubuline

Etude de la localisation de p53 en fonction des microtubules Rouge = p53 Vert = microtubules Jaune = merge 1A9 : carcinome ovarien humain (p53 sauvage) A498 : carcinome rénal humain (p53 sauvage) A549 : carcinome de poumon humain (p53 sauvage) PC3 : carcinome de la prostate humaine (mutation nulle de p53 ) ADR = adriamycin (DNA-damaging agent) p53 est co-localisé avec le réseau de microtubules cytoplasmiques Une altération de l’ADN entraine une accumulation de p53 dans le noyau

Etude de la localisation de p53 en fonction des microtubules Cellules A549 ( carcinome de poumon humain) traité avec de l’ADR Rouge = p53 Vert = microtubules Jaune = co-localisation de p53 avec les microtubules p53 est co-localisé avec le réseau de microtubules et des altérations de l’ADN entrainent son accumulation dans le noyau

Etude de la l’association de p53 avec les microtubules Cellules A549 Rouge = p53 Vert = microtubules Jaune = merge VCR = vincristine TX = paclitaxel La translocation nucléaire de p53 nécessite un réseau fonctionnelle de microtubules L’induction des gènes cibles par p53 est diminuée due à sa mauvaise translocation

Les protéines motrices des microtubules

Le complexe Dynéine/Dynactine La dynéine interagit via ses chaines intermédiaires avec la sous-unité P150glued de la dynactine

Transport de p53 Colonne 1 : cellules + microtubules purifiés Colonne 2 : cellules + microtubules purifiés + AMP-PNP Colonne 3 : cellules (absence de microtubules)+ AMP- PNP (ATP non hydrolysable) Colonne 4 : contôle p53 est transporté le long des microtubules grâce au complexe dynéine-dynactine

Le complexe dynéine/dynactine permet le transport de p53 vers le noyau Cellules A549 + dommage de l’ADN Rouge = surexpression de dynamitine Vert = p53 Cellules A549 + dommage de l’ADN Rouge = p53 Vert = cellule transfectée avec des anticorps anti-dynéine Le complexe dynéine/dynactine permet le transport de p53 vers le noyau

Etude de l’interaction de p53 avec la tubuline et les microtubules RBT = rat-brain tubulin RBMT = rat-brain microtubule Pp53 = p53 purifiée P = culot S = surnageant p53 interagit spécifiquement avec les microtubules in vitro Cette interaction est induite par les protéines qui sont associées aux microtubules comme la dynéine

Etude de la région amino-terminale de la protéine p53 Les 25 premiers acides aminés de la protéine p53 sont indispensables pour sa fixation aux microtubules

Etude de la région amino-terminale de la protéine p53 Cellules PC3 (p53-null) + ADR Rouge = p53 Vert = microtubules Jaune = merge Les 25 premiers acides aminés de la protéine p53 sont indispensables pour sa fixation aux microtubules

Conclusion Une altération de l’ADN entraine une translocation de p53 dans le noyau Cette translocation a lieu grâce à la dynéine via le réseau de microtubules Les 25 premiers acides aminés de la protéine p53 sont indispensables à sa fixation sur les microtubules

p53 microtubule dynéine noyau

Conclusion Une mauvaise translocation nucléaire de p53 (p53 inactif) est néfaste pour la cellule : Pas de transcription de p21 Pas de transcription de mdm2 Pas d’activation et pas de répression transcriptionnelle de nombreux gènes (bcl2, apaf-1,…) Plus de contrôle du cycle cellulaire Plus d’auto régulation de p53 (expression constitutive de p53) Plus de réparation de l’ADN Plus d’apoptose Cancers et maladies neurodégénératives

Discussion La liaison de p53 aux microtubules peut avoir diverses conséquences : Réglementation de la localisation cellulaire de p53 Stockage de p53 dans le cytoplasme via les microtubules Cible indirecte des agents se liant aux microtubules Interaction avec des protéines cytoplasmiques qui sont liées aux microtubules : L’interaction des PI3-K avec les microtubules permet la phosphorylation de p53 L’interaction des BRAC1 avec les microtubules permet la régulation de l’expression de p53

Perspectives Détermination des mécanismes précis permettant l’interaction de p53 avec les microtubules et avec la dynéine Détection des cancers et des maladies induites par une inhibition de la translocation nucléaire de p53 Mise en place de thérapie contre ces cancers et ces maladies

Bibliographie Cours de l’université de Lyon Molecular motors Manfred Schliwa and Günther Woehlke Nature 422, 759-765(17 April 2003) Cours de Bernard Mignotte Cours de Flore Renaud-Païtra Giannakakou, P. et al. Paclitaxel selects for mutant or pseudo-null p53 in drug resistance associated with tubulin mutations in human cancer. Oncogene 19, 3078–3085 (2000)

FIN