Analyse structurale et modélisation moléculaire des interactions protéine-sucre Anne Imberty Oct 2001

Les oligosaccharides …. Présentent un nombre presque infini de monomères (substitution…) Peuvent avoir différentes possibilités de liaison entre les monomères Contiennent des points de branchements Sont très difficile à cristalliser Sont difficiles à caractériser et à synthétiser Ne sont pas le produit direct d'un gène ( protéines) Ne se multiplient pas par PCR ( acides nucléiques)

Les N-glycannes des glycoprotéines Complexe Oligomannose Paucimannose Complexe (Lea ) a a 3 3 a b b a a 2 b b 4 4 2 2 3 3 4 4 a a a b b a a b b 2 2 2 3 2 2 6 a a a a a a a a 3 2 3 2 3 6 3 6 2 6 2 6 b b b b b b 4 4 4 4 a 3 3 6 a a b 4 b 4 b 4 b 4 Animal Plante GlcNAc Man Gal Fuc NeuAc Xyl

a-L-iduronic acid (1C4 et 2SO) Formes possibles des cycles pyranose Forme 4C1 : a-D-mannose, a-D-galactose... Forme 1C4 : a-L-fucose Cycle flexible: a-L-iduronic acid (1C4 et 2SO) Forme 2C5 : a-D-NeuAc

Banque des monosaccharides http://www.cermav.cnrs.fr/databank/monosaccharides/

La barrière d ’isomères et autres difficultés…. H Pour un hexamère : Oligosaccharides Peptides Nb Isomères > 1012 64 106 (pour 6 hexopyranoses) (20 acides aminés) _______________________________________ Quantité > 100 nmol < 100pmol Synthèse 20 semaines/homme 3 h (robot) D'après Laine R.A. (1994) Glycobiology, 4, 759-767

Particularités stéréolectroniques des glucides Effet anomère préférence configuration axiale et déformations géométriques Effet exo-anomère préférence conformation gauche From Woods, R. (1996) Reviews in Computational Chemistry, 9, 129-165

La liaison glycosidique bGlcNAc(1-2)Man

Banque de données des disaccharides http://www.cermav.cnrs.fr/databank/disacch/

Analyse structurale des oligosaccharides Cristallographie NMR Modélisation Minimum global Solution Phase condensée Conformation "bioactive"

Analyse de structures cristallographiques d'oligosaccharides Carte d'énergie (MM3) de la liaison glycosidique aFuc(1-2)Gal Groupe sanguin B (aGal1-3[aFuc1-2]Gal) (Otter et al. Eur. J. Biochem. 1999, 259, 295) Groupe sanguin O (aFuc1-2Gal) (Watt et al. Carbohydr. Res. 1996, 285, 1)

Difficultés spécifiques à la modélisation des oligosaccharides Particularités stéréo-électroniques - effet anomère et exo-anomère pour la liaison glycosidique - effet Hassel-Ottar pour les groupements CH2OH Grand nombre de groupements hydroxyles - importance des liaisons hydrogènes (intra et intermoléculaire) - effet de l'hydratation sur la conformation Problèmes de flexibilité - très grand nombre de conformations - corrélation entre mouvement internes et mouvement global

Champs de force pour la modélisation des sucres - General purpose force-field : MM3... - Modified force-field : CHARMM-Brady... - Updated force-fields :Amber-Glycam94, Tripos-PIM... New version of the PIM parameters* for - protein/carbohydrate interaction - N-glycosidic linkages - sulfated and phosphorylated sugars, nucleotide-sugars *Available at http://www.cermav.cnrs.fr/databank/pim/ Pour une comparaison : S. Pérez, A. Imberty et al. (1998) Carbohydr. Res. 314, 141-155.

Exploration de l'espace conformationnel Recherche systématiques de toutes les conformations possibles cartes rigides ou relaxées Méthodes heuristiques : Cheminement "intelligent" dans les régions de basses énergies de la Surface d'Energie Potentielle. Programme CICADA basé sur l'approche SCD (Single Coordinate Driving) Méthodes statistiques. Algorithme Monte-Carlo-Metropolis utilisé pour explorer l'espace des angles dièdres Dynamique Moléculaire permet de prendre en compte les molécules d'eau de manière explicite et traiter les problèmes conformationnels dépendant du temps.

La transplantation d'organe Environ 200 000 personnes dans le monde sont en attente d'une greffe d'organe Allogreffe 63 635 (Juin 99 aux USA) Liste d'attente Xenogreffe Organes transplantés Xeno (D.K. Cooper & R.L. Lanza) Oxford University Press, 2000 Discordante Concordante

Le xénoantigène aGal1-3bGal1-4GlcNAc aGal-Lewis X Groupe sanguin B

La liaison glycosidique aGal(1-3)Gal Carte relaxée MM3 F Y B C A. Imberty, E. Mikros, K. Koca, R. Molliccone, R. Oriol & S. Pérez (1995) Glycoconj. J. 12, 331-349

Exploration intelligente de l'espace Visite des vallées de basse énergie par la méthode SCD (Single Coordinate Driving Method) Koca J. (1994) J. Mol. Struct. (THEOCHEM) 308, 13

Familles conformationnelles B < 10%

Etude par dynamique moléculaire dans l'eau AMBER + GLYCAM) Hydratation (module XLEAP) Minimization (module Sander) Heating (module Sander) Equilibration (module Sander) Production by 2 fs step (3 ns total) (module Sander) Analyze (module Carnal)

Historique de chacune des liaisons glycosidiques b b a a b b

Comparaison des trajectoires MD et de la carte d'énergie A B C F. Corzana, E. Bettler, C. Hervé du Penhoat, T.V. Tyrtysh, N.V. Bovin & A. Imberty (2001) Glycobiology (sous presse)

Interactions protéine-sucre

Structures 3D de lectines Nouvelle version disponible maintenant 3D Lectin Database (http://www.cermav.cnrs.fr/databank/lectine/)

Structures 3D de lectines de légumineuses Complexes connus avec - mannose/glucose (ConA, LcL..) - GlcNAc (UEA-II) - galactose/GalNAc (EcorL, DBL…) - oligosaccharides complexes (GSIV) Pas de structure avec complexées avec le fucose ou l'acide sialique ?

Griffonia simplicifolia Lectines utilisées pour la détermination des types sanguins Ulex europaeus (UEA-1) Maackia amurensis (MAL) Dolichos biflorus (DBL) Griffonia simplicifolia (GSI-B4) Europe Japon Inde Afrique a-L-Fuc complexe a-D-GalNAc a-D-Gal NeuAc Gal Glc Siallylactose Gal Fuc GalNAc Type A Gal Fuc Type B Type O Gal Fuc GlcNAc Leukoagglutinin de Maackia amurensis (MAL)

Structure cristallographique du complexe MAL/SLac Résolution 2.75 Å groupe d'espace P 21 21 2 A. Imberty, C. Gautier, J. Lescar, S. Pérez, L. Wyns & R. Loris (2000) J. Biol. Chem. 275, 17541-17548.

Interaction entre le trisaccharide et la protéine Tyr221 Tyr136 Ser104 Tyr45 Glu224 Tyr131 Asp137 Ser86 Lys107 Asp87

Interaction entre le trisaccharide et la protéine Tyr137 Lys107 Tyr131 Tyr221 Ser104 Tyr45

Comparaison du mode de liaison de différents monosaccharides par les lectines de légumineuse Asn133 Asp89 Gln219 Ala218 Phe131 Gly107 Gal in EcorL Asn14 Asp208 Leu99 Arg228 Tyr12 Man in ConA Tyr136 Tyr131 Tyr45 Asp137 Asp87 Gal in MAL

Conformations observées dans les complexes cristallographiques entre lectines de légumineuse et oligosaccharides aMan(1-3)Man bGlcNAc(1-2)Man aNeuAc(2-3)Gal Plant lectins Animal lectins A. Imberty & S. Pérez (2000) Chem. Rev. 100, 4567-4588. Microbial lectins

Conclusions sur les interactions protéine-sucres Grand nombre de liaisons hydrogène Importance des acides aminés aromatiques dans la specificité La conformation "bioactive" n'est pas toujours le minimum global de l'oligosaccharide en solution C.A. Bush, M. Martin-Pastor & A. Imberty (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 269-293.

Modélisation moléculaire des interactions lectine-sucre - Construire la protéine - Amarrer un monosaccharide dans le site de reconnaissance - Propager l'oligosaccharide à la surface de la protéine - Valider le modèle

Docking du monosaccharide dans le site Uitlisation du programme GRID avec les sondes OH et CH Visualisation de la surface de Connolly de la protéines (MOLCAD) Rouge : sonde OH Vert : sonde CH Test sur complexe connu GRID : Goodford P.J. (1985) J. Med. Chem. 28, 849

Conclusions : bonne prédiction des géométries Exemple : comparaison entre le modèle et la structure cristallographique pour le complexe DBL/GalNAc A. Imberty, F. Casset, C.V. Gegg, M.E. Etzler & S. Pérez (1994) Glycoconj. J. 11, 400-413

Les problèmes à résoudre dans le futur : 1. Modéliser les interaction entre protéines et glycosaminoglycanes ...aGlcNAc(6S)1-4bGlcA(1-4) aGlcNS(3S,6S) (1-4a) IdoA(2S) (1-4) aGlcNS(6S)...

Exemple : Modèle d'interaction entre la chimiokine SDF-1a et l'héparine Problèmes : nombre de contact, flexibilité, spécificité R. Sadir, F. Baleux, A. Grosdidier, A. Imberty & H. Lortat-Jacob (2001) J. Biol. Chem. 276, 8288-9296

2. Prédire les constantes d'affinité entre protéine et sucre K = e -DG°/RT Pentasaccharides DG° = DH° -T DS° Mono et disaccharides Problème de compensation enthalpie-entropie Comment évaluer le terme entropique ? Contribution : - perte de degrés de liberté rotationnelle et translationnelle - solvatation - perte de la liberté conformationnelle S°flex= -RSpiln(pi)

Collaborations CERMAV Grenoble Catherine Gautier Julien Lescar Christelle Breton Valérie Chazalet Emmanuel Bettler Francisco Corzana Julie Verleyen Serge Pérez ESRF Grenoble Ed Mitchell Veronica Cox St-Genesius-Rode Remy Loris Lode Wyns The Xenotransplantation European Network Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC)