Mucoviscidose Agnès Ferroni Necker 9/9/08

Mucoviscidose (MV) = fibrose kystique du pancréas maladie génétique autosomale récessive Maladie génétique la plus fréquente dans la population blanche d ’Europe et d ’Amérique du nord « caucasienne »). France : une naissance sur 2500 250 nouveaux cas / an 4000 à 6000 sujets atteints une personne / 25 est hétérozygote (sain) 100 décès/an (90% : atteinte respiratoire) Espérance de vie à la naissance : 47 ans Âge moyen des décédés : 24 ans

1938 : première description de la fibrose kystique du pancréas 1985 : découverte du gène responsable de la maladie 1989 : clonage du gène 230 kb, chromosome 7(position 7q31) code pour la protéine transmembranaire CFTR (1480 aa, 170 kDa) (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) Plus de 1000 mutations décrites

Anomalies moléculaires de CFTR Répartitions en 6 classes de mutations : 1 : absence de synthèse 2 : défaut de maturation cellulaire 3 : défaut de régulation 4 : anomalies de conduction 5 : synthèse réduite de la protéine 6 : défaut de stabilité mutation majoritaire  F 508 : défaut de maturation de CFTR maladie sévère (insuffisance pancréatique + atteinte respiratoire) 70% des mutations en France

Protéine CFTR Famille des protéines ABC (ATP Binding Cassette) Localisation : glandes sudoripares, cellules alvéolaires et bronchiques, intestin, pancréas, vésicule biliaire, glandes salivaires, tractus génital (canaux déférents et épididyme) Fonctions cellulaires multiples Rôle de canal ionique pour le passage sélectif des ions Cl - Autres rôles Transporteur de substrats (ATP, glutathion..) Régulateur de la sécrétion de mucines Rôle dans les processus de défense contre l ’infection Recepteur cellulaire permettant l’internalisation de P. aeruginosa et sa clairance (Pier, PNAS 1997)

Anomalies des sécrétions hydro-électrolytiques au niveau pulmonaire 2Cl K Cl Eau Normal CFTR mucoviscidose

Conséquence physiopathologique: atteinte respiratoire conditionne le pronostic de la maladie Anomalie du gène Anomalie de CFTR Anomalie du liquide de surface des voies aériennes Obstruction bronchique Infection chronique (stagnation des germes) Inflammation Dilatation des bronches

Autres aspects physiopathologiques de la MV liés à la production de sécrétions visqueuses 1 - insuffisance pancréatique exocrine avec malnutrition (relation génotype/phénotype) Maldigestion et malabsorption par obstruction des canaux pancréatiques (<2% de sécrétion normale) Association de : diarrhée chronique graisseuse, amaigrissement, déficit acides gras essentiels , vitamines liposolubles ADEK et sels biliaires fibrose progressive du pancréas ----> diabète sucré (5-10% des cas) 2 - autres manifestations IIéus méconial, ictère rétentionnel, cirrhose biliaire, déshydratation aigue si exposition chaleur (perte excessive de sels), stérilité masculine (azoospermie obstructive 98% des cas), atteinte ORL (polypes, sinusite)

Diagnostic Test de la sueur (à partir de 5 semaines) Mesure de la concentration en Cl- sur un échantillon de sueur N ≤ 40 mmol/l 40-60 mmol/l : douteux > 60 mmol/l sur 2 tests : pathologique Différence de potentiel nasal sur les formes atypiques (à partie de 6 ans) Génotypage : recherche des mutations (sang) si enfant trop jeune pour le test de la sueur Dépistage néonatal : dosage de la trypsine immunoréactive (TIR) Si ≥ 65 µg/l : recherche des principales mutations Dépistage anténatal : prélèvement des villosités choriales à la 10ème semaine et diagnostic direct par identification des mutations CFTR

Prélèvements bactériologiques ECBC quantitatif après l’induction d’une toux Fréquence des ECBC / 3 m ou en cas d ’exacerbation /1m dans les suites d ’une primo-infection LBA : ECBC non contributif et aggravation clinique et/ou radiologique, jeune enfant Prélèvement oropharyngé Nourrisson Malade non sécrétant

Valeur diagnostique du prélèvement oropharyngé/ LBA Ros e n fe ld M P di a t r Pulmonol , 1999 Ar mst ong, D tr 1996 se udomona s uginos < 18 moi n=119 > n=82 nnés dé pis té n=75 rév l c (% ) 9 (8%) 19 (23%) S ibilité % (95% C I 44 (14,79 68 (43,87 71 (44-90) Spéc ifi ité (95 95 (90,99 94 (85,98 93 (89-97) Va leu pré tiv + 76 (50,93 57 (34-78) - 91 (81,97 96 (91-99) Un prélèvement oropharyngé négatif est utile pour éliminer une infection à PA

Analyse microbiologique des prélèvements pulmonaires Qualité des analyses microbiologiques très variable en fonction des laboratoires Familiarisation des techniciens Délai de mise en culture Identifications bactériennes Antibiogrammes : milieu solide obligatoire 1) Fluidification du crachat 2) Quantification des cultures par dilutions (eau distillée) 3) Ensemencement sur des milieux spécifiques

Milieux et conditions de culture pour l’étude des sécrétions bronchiques Milieux de culture Cétrimide Gélose chocolat Isovitalex Cullture quantitative (10-3, 10-6) Milieu de Chapman Gélose au sang Milieu cepacia (col + tic) Milieu Sabouraud Conditions d ’incubation 48 h à 35°C puis 6 jours à 6° ambiante 48 h à 35°C sous CO2 puis 6 jours à T° ambiante 3-7 J à 35°C Bactéries isolées P. aeruginosa Toutes dont H. influenzae S. aureus S. pneumoniae Burkholderia spp ± Alcaligenes ± Stenotrophomonas Candida Aspergillus

Méthodes d ’identification des bacilles à Gram négatif non fermentants Phénotypiques P. aeruginosa : Difficulté d’identification car aspect souvent très atypique des colonies (naines, muqueuses, incolores…) Galeries API NE souvent mises en défaut Identification présomptive à Necker : culture + sur milieu ordinaire à 41°C, sur milieu cétrimide à 30°C, pigment +, antibiogramme… Autres germes non fermentants (A. xyloxosidans, S. maltophilia, B. cepacia) : Galeries API NE incubées de façon prolongée (3 J) Génotypiques séquençage ARNr 16S et 23S, PCR RFLP ARNr 16S, RFLP recA, AFLP... Necker : séquençage d ’une partie de l ’ARNr 16S (400bp) => diagnostic d ’espèce MALDITOF +++

Evolution de la prévalence des principales bactéries avec l ’âge des patients Espèces En fa nt < 18a % A dult e ≥18a % S A (MS) 60,4 47,8 S A (M R ) 9,3 9,9 HI 36,3 17,5 P neumo c oque 9,5 1,7 P A 36,3 67,8 B c e paci a 2,2 5,1 A xylosoxidans 1,7 5,4 S m a ltoph i li a 4,9 5,1 A F 13,2 23

(exopolysaccharides polymère de ß-D-mannuronate--L-glucuronate) Caractère mucoïde de P. aeruginosa facteur de virulence spécifique de la MV Mucus = alginate (exopolysaccharides polymère de ß-D-mannuronate--L-glucuronate) souches polyagglutinables, LPS défectif (chaine O absente, lipide A altéré) Reflet de l’adaptation de la bactérie à son hôte, déclenché par la pression environnementale (stress nutritionnel) Produit par toutes les souches de PA isolés de patients MV mais apparait phénotypiquement au stade chronique

Conséquences du morphotype mucoïde Formation de microcolonies engluées au sein d ’un biofilm Augmentation de la viscosité des sécrétions et de l ’adhérence du germe aux cellules épithéliales Clairance ciliaire diminuée Echappement du germe à la réponse immunitaire (phagocytose) Protection du germe contre l’action des antibiotiques Survie prolongée des germes

P. aeruginosa muqueux

Infection à Staphylococcus aureus SA est le germe le plus fréquemment rencontré chez le nourrisson et l ’enfant . Il participe à la constitution d ’un état inflammatoire précoce favorisant l ’implantation du PA Portage nasal de SA 66% des CF versus 32% des sujets sains

S. aureus : traitement Traitement optimal non défini Colonisation chronique : forme sévère: antibiothérapie séquentielle (TMP-SMX, oxacilline, cephalos I) en cures de 15 J Au coup par coup en fonction des exacerbations

Infection à SA : prophylaxie primaire Arguments pour : • Effet délétère de S. aureus sur les poumons Arguments contre : • Risque d’une colonisation plus rapide à P. aeruginosa (démasquage des récepteurs spécifiques des adhésines de P. aeruginosa) • Risque d ’émergence de colonies mutantes naines (bactrim) Etude multicentrique en double aveugle sur 7 ans, début < 2 ans Cephalexine 80 à 100 mg/kg versus placebo 209 patients , 109 suivis 5 à 7 ans Pas de différence clinique, fonctionnelle respiratoire Groupe traité Diminution de SA 6% versus 30,4% augmentation de PA 25,6% versus 13,5% dès la première année et persistant durant l ’étude Prophylaxie primaire non recommandée Nécessité d ’autres études avec d ’autres molécules Stutman, J Pediatr 2002

antibiothérapie antipyocyanique  améliore l ’état clinique et conditionne le maintien d’un bon état pulmonaire.  diminue significativement le taux de bactéries, mais de façon transitoire. Principales molécules utilisées : tazocilline, ceftazidime, imipénème, méropénème, tobramycine, ciprofloxacine L’antibiogramme reflète très imparfaitement les conditions réalisées in vivo (inoculum, enkystement, pénétration)  les concentrations d ’antibiotiques sont souvent subbihibitrices. Macrolides : effet bénéfique des concentrations prolongées subinhibitrices d ’azithromycine  action antiinflammatoire et bactéricide (Tateda, AAC 1996) Pharmacocinétique particulière des antibiotiques dans la MV -  demi-vie d ’élimination -  VD  utilisation de fortes posologies

Administration des ß-lactamines injections au moins 4 fois/jour et  de 20-30% des doses Administration des aminosides Dose unique journalière : pic sérique  et résiduelle   concentrations tissulaires bronchiques  et risque d ’ototoxicité  • AMK : 35 mg/kg/j, pic sérique et résid attendus : 50 mg/l, < 1 mg/l • TM : 15 mg/kg/j pic sérique et résid attendus : 25 mg/l, < 5 mg/l • Contrôle des taux sériques au moins la 1ere semaine de tt. Voie inhalée par aérosols : • Concentrations 10 à 80 fois > voie veineuse, toxicité systémique faible • commodité d ’utilisation mais posologie effectivement délivrée très variable • Granulométrie stricte : 1 à 3 µ, délivrance = 10% du volume nébulisé • colimycine 1- 2 M u, tobramycine (Tobi*) 10 mg/kg (Ramsey, NEJM 1999)

Stratégie thérapeutique antipyocyanique I - primo infection : 2 stratégies 1) thérapeutique orale (frederiksen, 1997, pediatr pulmonol) Ciprofloxacine orale 15- 21 J + aérosols de colimycine pendant 3 mois  réduction significative du passage à la colonisation définitive 2) traitement IV d ’emblée (Necker) Céphalo III + aminoside pendant 15- 21 J   négativation des crachats + ATB inhalé poursuivi 3 à 6 mois (2 à 3 fois/J)  éradication possible du germe à ce stade

II - infection chronique (± précipitines ≥ 2 arcs) ≥ 106 UFC/ml lors de 3 examens successifs de l ’expectoration sur 6 mois (± précipitines ≥ 2 arcs) Eradication impossible Le plus souvent souches mucoïdes : alginate Croissance bactérienne ralentie : diminution de l ’activité des bêtalactamines anaérobiose locale, PH diminué : diminution de l ’activité des aminosides Inoculum important sensibilité mesurée sur des inocula de 105 bactéries /ml

Cures : bithérapie adaptée 15 J Aminosides : efficacité cc-dépendante =>une injection quotidienne Céphalosporines en perfusion continue si possible École danoise : cures séquentielles/ 3 mois systématiques ß-lactamines - aminosides 15 j École nord-américaine : tt en fonction des poussées infectieuses (env 3 cures/ an)  réduction de l ’inoculum  amélioration clinique période intercure : traitement non codifié Necker : • aérosols au long cours : 2 séances / jour  fréquence exacerbations,  inoculum,  fonctions respiratoires • ± azithromycine

Raisons d ’un échec thérapeutique obstacle à la pénétration des ATB : • sécrétions bronchiques anormalement épaisses • enkystement des PA mucoïdes au sein d ’un biofilm diminution de l’activité intrinsèque des ATB aminosides : PH acide, anaérobiose locale, adsorption sur le mucus… ß-lactamines : Multiplication bactérienne ralentie Effet inoculum: 108 à 109 UFCFU/ml dans l ’expectoration en cas d ’infection (antibiogramme : 105 bactéries) -> résistance in vivo malgré sensibilité in vitro En cas de succès clinique : Amélioration état général, épreuves respiratoires, radio , gain pondéral, inflammation ++ Bénéfice encore détectable 1 à 3 mois après la fin de la cure Plusieurs raisons peuvent axpliquer l ’absence d ’éradication malgré d ’un tt optimal : d ’abord l ’épaisseurs des sécrétions bronchiques qui constituent des véritables poches de rétention et qui sont un véritable obstacle à leur pénétration. Ensuite, c ’est le sanctuaire bactérien représenté par l ’enkystement des bactéries productrices d ’alginate au sein d ’un biofilm, La 2eme raison, c ’est la présence de puissants facteurs d ’inhibition contenues dans le mucus : Pour les aminoisides, c ’est entre autres le PH acide des sécrétions bronchiques, …, l ’adsorption des aminosides sur les mucines. Pour les blactamines, c ’est la multiplication ralentie des bactéries qui ne sont plus en phase expo de croissance, en dormance dans cet atmosphère anaérobie. (Lors de l ’association avec 1 ßlactamines seule celle ci sera active, d ’ou le risque démargence de mutants R aux blactamines). Les bact ne sont plus en phase exponentielle de croissance Amélio clin souvent spectaculaire, reprise pondérale plus sem à plus mois, restau fct resp, Nette régression des paramètres biologiques de l ’inflammation