La PCR quantitative en temps réel

Sommaire Présentation générale : principes de la PCR en temps réel Démarche et exemples de résultat Exploitation des résultats : technique de la gamme et du 2-DDCt

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PCR en temps réel, « Quantitative PCR », « Real time PCR », « Kinetic PCR », « Real time RT PCR » (sur ADNc), « FRET PCR » (Förster resonance energy transfer ) Formation du produit PCR suivie au cours du temps via l’émission de fluorescence in situ (nombreuses approches possibles – cf. infra). Détermination du nombre de cycle à partir duquel le produit PCR est détectable : nombre de cycle seuil = « Cycle threshold » (ou « crossing point » = Ct. Moment d’apparition du signal seuil (=Ct) dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié. quantification de la matrice de départ et/ou calcul de ratios entre deux conditions

Utilisée pour quantifier de : - l’ADN génomique : par exemple, détection/quantification de microorganismes dans un tissu (qql pg/µl - mais attention, la présence d’ADN ne permet pas de conclure quant à la viabilité de l’organisme détecté). - ou des ADNc produits à partir des ARNm après réverse transcription : détermination/comparaison du niveau d’expression de certains gènes. Aussi utilisée pour mettre en évidence de mutations ponctuelles (homo/hétérozygotie, résistance aux antibiotiques dans des gènes) à l’aide de sondes taqman très spécifiques ou l’interprétation des courbes de fusion, par exemple.

Principales techniques de la fluorescence au cours de la PCR

Principe de la détection des produits PCR par émission de fluorescence par un agent intercalant TaqMan: Principe de la détection des produits PCR par libération de fluorescence lors de la dégradation d’une sonde de type TaqMan® Le SybrGreen est un fluorophore s’intercalant dans le petit sillon de l’ADNdb QuantiProbe: Principe de la détection des produits PCR par libération de fluorescence par dénaturation d’une sonde lors de son hybridation sur sa séquence cible FRET: Principe de la détection des produits PCR par fluorescence lors d’un transfert d’énergie par résonance (FRET) lors de l’hybridation de 2 sondes sur leur séquence cible conduisant à un rapprochement des fluorophores

Lecture de la fluorescence : Après l’élongation : SYBRGreen™, technique Taqman™ A l’étape d’hybridation : Molecular Beacons™, LightCycler® hybridization probes

Nature des fluorochromes reporters : - FAM : bleu - VIC : vert - NED : noir - PET : rouge Meilleur quenching Avantages de la Q-PCR avec sondes : - très spécifique (car cette PCR nécessite l’utilisation de deux amorces et d’une ou plusieurs sondes spécifiques) - possibilité de faire des multiplexes i.e. plusieurs PCR dans le même tube : détection de fluorochromes différents indicateurs de PCR différentes dans le même tube Þ quantification relative directe, meilleure normalisation. Limites : coût des sondes (surtout si nombreux gènes différents à quantifier)

Limite de la technique SYBER-green® : risque de détection des dimères d’oligonucléotides ou d’un produit PCR non spécifique contrôle lors de la mise au point par dépôt sur gel de la présence d’une seule bande contrôle à chaque réaction de la présence d’un seul produit PCR par évaluation du Tm du produit PCR à l’aide de la courbe de fusion (contrôle qu’il n’y a bien qu’un seul produit, avec le bon Tm)

Remarque : Différence entre la PCR quantitative et la PCR semi-quantitative La PCR semi-quantitative est une PCR après laquelle (technique en point final) la quantité de produit est quantifiée sur gel. En parallèle, est effectué un témoin positif (standard) d’amplification dont la quantité est inchangée dans les différentes conditions comparées. La PCR quantitative repose sur la mesure continue d’une libération de fluorescence au cours des cycles de PCR reflétant l’accumulation de produit PCR. L’aspect quantitatif réside dans la détermination du Ct (« cycle threshold » ou « crossing point ») qui correspond au nombre de cycles minimum nécessaire pour que la fluorescence dépasse le seuil (fixé au dessus du bruit de fond – début de phase exponentielle d’amplification).

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Exemple de protocole de PCR en temps réel Programme : Dénaturation : 95°C 10’ Amplification : 45X (95°C 10’’, 60°C 10’’, 72°C 10’’) Cooling : 40°C 30’’

Spécificité des amorces Vérification sur gel que les amorces n’amplifient bien qu’une bande eau 10 ng 5 ng 1 ng 0,5 ng

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Technique des 2-(DDCt)

Illustration de la formule

Ratio du nombre de transcrits amiF après une croissance à pH5/pH7 Exemple AmiF RpoB CtpH7 : 23,6 (0,2) CtpH7 : 16,0 (0,1) CtpH5 : 21,3 (0,1) CtpH5 : 16,2 (0,1) Ratio du nombre de transcrits amiF après une croissance à pH5/pH7 = 2-[(21,3-16,2)-(23,6-16,0)] = 5,6