Nature Neuroscience March 2005 Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Dimitris Bourikas, Vladimir Pekarik, Thomas Baeriswyl, Asa Grunditz, Rejina Sadhu, Michele Nardo & Esther T Stoeckli. Nature Neuroscience March 2005

Ce que l’on sait… Pendant développement circuits neuraux, croissance axones répond signaux attractifs et répulsifs  guidage jusqu’aux cellules cibles  établissement contacts synaptiques. Signaux agissent à distance ou localement à des points précis. Un des modèles les plus connus = navigation axones des neurones commissuraux (= interneurones) localisés au niveau moelle épinière dorsale.

Coupe transversale de la moelle épinière

Vue aérienne de la plaque du plancher

But de l’article: Identifier une nouvelle molécule de signalisation guidant les axones commissuraux rostralement.

Pourquoi dans plaque du plancher? But hybridation soustractive: identifier gènes plaque du plancher exprimés différentiellement aux stades de développement 20 et ~25 pouvant être candidats pour rôle guidage neurones commissuraux. Pourquoi dans plaque du plancher? Axones neurones commissuraux tournent en étroit contact avec le bord de plaque du plancher. En absence de cette dernière, chez plusieurs vertébrés, les axones ne tournent pas. Pourquoi stades de développement 20 et ~25? Au niveau lombosacral, stade 25: axones tournent  expression gène(s) candidat(s) devrait être la plus haute. Au niveau lombosacral, stade 20: axones n’ont pas encore atteint plaque du plancher  expression gène(s) candidat(s) devrait être nulle ou très faible.

Hybridation soustractive

Sélection des clones dont expression restreinte dans la plaque du plancher aux stades 23-26.  A partir des ces ADNc génération de sondes pour hybridation in situ et RNAi pour in ovo silencing.

But figure 2: analyse fonctionnelle des gènes candidats par in ovo ARN interférence chez embryon poulet. Protocole: à partir ADNc gènes candidats obtenus précédemment, synthèse dsRNA (ARN double brin) et injection dans canal central moelle épinière + électroporation aux stades 18-19  inhibition expression gènes cibles. Observation comportement axones neurones commissuraux au stade 25.

Shh dirige croissance axones commissuraux rostralement. dsRNA 3’-UTR SHH Pas de différence dans croissance vers et à l’intérieur de la plaque du plancher. Majorité axones ne tournent pas et parmi ceux qui tournent, beaucoup tournent caudalement. Shh dirige croissance axones commissuraux rostralement. * Identification gène SHH par comparaison avec banques cDNA. dsRNA N-ter Shh (après identification gène)

Vérification rôle Shh. Protocole: injection dans le canal de la moelle épinière d’anticorps bloqueurs de fonction dirigés contre Shh et de cellules hybridomes exprimant cet anticorps.  Phénotype identique in ovo RNAi.

Vérification résultats pas dus interférence avec ce processus. Protocole: observation profils expression gènes codant facteurs transcriptions réprimés: PAX7 ou induits: NKX2.2 et ISL1 par SHH lors inactivation celui-ci aux stades 18-19 et comparaison avec contrôle. A ce stade, l’inactivation de SHH n’a pas d’effet sur le processus précédemment décris.  Rôle direct de Shh dans guidage axones commisssuraux.

But figure 3: les co-récepteurs Ptc (Patched) et Smo (Smoothened), médiant par exemple rôle Shh dans croissance axones commissuraux, médient-ils rôle Shh dans virage rostral? Protocole: hybridations in situ pour observer expression Axonin-1 (contrôle), Smo et Ptc au stade 23. Comme expression SMO influencée par Shh, idem en présence dsRNA contre SHH. Inhibition Smo par injection cyclopamine aux stades 19-20 ou par RNAi in ovo et observation comportement axones commissuraux.

Pas d’expression de Smo ni de Ptc dans neurones commissuraux Pas d’expression de Smo ni de Ptc dans neurones commissuraux. Idem avec dsRNA contre Shh. Pas d’effet quand inhibition Smo sur guidage axones commissuraux.  Smo et Ptc pas impliqués dans rôle de Shh dans le guidage des neurones commissuraux.

But figure 4: est-ce que Hip (Hedgehog interacting protein), protéine transmembranaire connue pour lier toutes les protéines Hedgehog de vertébrés, pourrait médier le rôle de Shh dans virage rostral? Protocole: hybridation in situ aux stades 23, 24 et 26 pour comparer expression Hip.

Expression significative de Hip uniquement au stade 24 (lors virage rostral).  Hip pourrait être le récepteur de Shh impliqué dans ce processus.

But figure 5: le récepteur de Shh dans la guidage des axones commissuraux est-il Hip? Protocole: in ovo RNAi contre HIP et observation comportement axones commissuraux.

Même phénotype que pour inactivation SHH.  Hip = récepteur Shh impliqué dans guidage axones commissuraux.

But figure 6: déterminer si Shh agit comme un chimioattractant ou comme un chimiorépulsif. Protocole: hybridation in situ pour observer expression Shh au stade 25.

Shh est exprimé à un plus haut niveau caudalement.  Shh semble avoir un rôle répulsif.

But figure 7: vérification effet répulsif Shh. Protocole: expression ectopique Shh par transfection plasmide codant pour Shh et EGFP par électroporation in vivo dans parties thoracique et lombosacrale supérieure de la moelle épinière d’embryons et d’un seul côté. Observation comportement axones commissuraux à différents niveaux.

Visualisation expression ectopique de Shh à différents niveaux. thoracique lombosacral supérieur lombosacral caudal

Axones commissuraux ne tournent pas à des niveaux de fortes concentrations de Shh, et à des niveaux plus bas, ne tournent pas ou tournent caudalement (gradient inversé). Axones émanant du même côté que les cellules transfectées ont un comportement normal.  En accord avec rôle répulsif Shh.

But figure 8: confirmer, in vitro, rôle répulsif Shh. Protocole: marquage neurones commissuraux dorsaux avec Dil et prélèvement d’explants d’embryons de stades 24-25. Culture sur collagène en présence de billes trempées ou non dans Shh et observation comportement neurones marqués.

En face des billes Shh, pas de croissance axonale ou si c’est le cas, axones tournent dans direction opposée dés qu’ils entrent dans gel collagène.  Shh a bien un rôle répulsif sur les axones commissuraux.

Conclusion Shh dirige les axones commissuraux rostralement le long de l’axe longitudinal de la moelle épinière après leur traversée de la ligne médiane in vitro et in vivo. Hip médie l’effet répulsif de Sonic hedgehog sur les axones des neurones commissuraux, contrairement à Ptc et Smo intervenant dans l’effet attractif de Shh.

Discussion Hip  pas de domaine intracellulaire  comment transmet-il signal Shh?  En analogie avec Ptc et Smo pourrait être composant d’un complexe récepteur dont il serait sous unité de liaison à Shh et dont sous unité transmettant signal n’aurait pas encore été identifiée.

Silencing Shh aux stades 18-19 pas d’effet sur attraction axones commissuraux vers plaque du plancher.  Soit taux résiduel Shh suffisant, soit in vivo nétrine suffisante. Shh  expression Sfrps (secreted frizzled-related proteins)  inhibiteur effet Wnt4 lors guidage axones commissuraux.  Hypothèse: coopération Shh, Sfrps et Wnt4 pour renforcement gradient Wnt4. Chez embryon souris et poulet  profils expression complémentaires et interactions compétitives de Wnt4 et Sfrp2  Expériences fonctionnelles in vivo nécessaires pour tester hypothèse.