Différenciation des cellules épithéliales Frédéric André UMR Inserm 911-Marseille frederic.andre@pharmacie.univ-mrs.fr

épithélium Les cellules épithéliales sont étroitement juxtaposées pour constituer des feuillets, appelés épithélium, qui ont pour fonction principale le revêtement ou la constitution de glande. Les épithélium se caractérisent par : des mécanismes d’adhésion intercellulaire, d’adhésion avec la matrice extracellulaire et par leur différenciation (absorption, sécrétion, barrière)

différenciation?? C’est l’ensemble des processus aboutissant à l’acquisition, par une cellule donnée, de structures et de fonctions spécialisées

Pourquoi l'intestin pour modele? Différenciation au cours de l'organogénèse Différenciation chez l'adulte le long de l'axe crypte-villosité

Organogénèse de l'intestin endoderme mésenchyme

Intestin adulte Principal organe d'absorption Barrière entre milieu extérieur et le milieu intérieur Possede de nombreuses modifications structurales permettant d’accroître la surface d’absorption

Structure de l'intestin:les replis transversaux

Structure de l'intestin:les villosités

Structure de l'intestin:les microvillosités

Les différentes zones villosité col crypte

Les quatres principaux types de cellules

Cellules en gobelet (à mucus)

Cellules entéroendocrines

Cellules de Paneth

Cellules absorbantes (entérocytes)

Les entérocytes

donc… 2 spécifications différentes 4 types cellulaires différents Localisations différente Et pourtant proviennent de la même cellule

Devenir d'une cellule souche MORT Différenciation Tris (rester dans les cryptes ou migrer?) Spécification (absorbtion ou secretion?) Prolifération Auto-renouvellement

Cellules souches division asymétrique

balance prolifération différenciation

Un cas particulier: la restitution intestinale blessure dédifferenciation migration prolifération différenciation

Quels f acteurs induisent la différenciation cellulaire?

Décidément, l’environnement est à la mode… Matrice extracellulaire

Et les cellules du mésenchyme ???

La matrice extracellulaire D'après de Duve C: une visite guidée de la cellule

La matrice extracellulaire Ensemble des macromolécules extracellulaire du tissu conjonctif

Une vieille expérience... Matrice extracellulaire et différenciation

Cellules de crypte PL ECM

Cellules de villosité PL ECM

La lame basale

La lame basale

Les isoformes de laminine

Les isoformes de laminine dans l'intestin

Laminines et organogénèse

INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France. Laminin isoforms: biological roles and effects on the intracellular distribution of nuclear proteins in intestinal epithelial cells INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France. Turck N, Gross I, Gendry P, Stutzmann J, Freund JN, Kedinger M, Simon-Assmann P, Launay JF. Experimental Cell Research 303 (2005) 494-503

Cellules CaCo2 Rôle dans: L’adhésion La prolifération Ln-1 Rôle dans: L’adhésion La prolifération La différenciation Ln-2 Ln-5 Ln-10

isoformes de laminine et adhésion des cellules intestinales

étalement

conclusions Les isoformes de ln ont des effets differents sur l'adhésion et l'étalement des cellules. La ln -10 est la plus adhésive, suivie de la ln-2 et ln-5 et de la ln-1. Les isoformes de ln sont donc distincts fonctionnelement.

ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION

ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION

Conclusions Morphologie des cellules: clones plus petits lorsque les cellules sont déposéee sur ln-1. (cellules plus compactes sur ln-1) Prolifération: ln-2, ln-5 et ln-10 mais pas la ln-1 augmentent la prolifération des cellules Ln-2, ln-5 et ln-10 fournissent des stimuli de prolifération.

ISOFORMES DE LAMININE ET DIFFERENCIATION ARNm

protéines

conclusion Seule la ln-1 induit la différentiation des enterocytes via l'induction du facteur de transcription cdx-2?

Cdx-2 et differenciation Gene homeotique retrouvé dans l’intestin. Transfection des cellules Caco-2 par: Cdx-1 sens: surexpression de cdx-1 Cdx-1 antisens: association avec l'ARNm de cdx-1 endogène; sous expression de cdx-1 Cdx-2 sens: surexpression de cdx-2

Cdx-2 et differenciation ctrl cdx1S cdx2S Cdx1AS Courbe de croissance

Cdx-2 et differenciation ARNm

Cdx-2 et differenciation protéines

Cdx-2 induit la différenciation des cellules intestinales conclusion Cdx-2 induit la différenciation des cellules intestinales

Conclusion générale Les isoformes de ln n'ont pas la même fonctionnalité. ln-1 induit la différenciation ln-2, ln-5, ln-10 stimulent l'adhésion et la prolifération Les isoformes de ln participeraient à l'equilibre prolifération/différenciation.

Autres systèmes cellulaires... La ln-1 induit aussi la différenciation des glandes mammaires... Elle contrôle la transcription des protéines du lait Le mecanisme fait intervenir STAT 5 La ln-1induit aussi la différenciation des glandes thyroïde...via d’autres facteurs de transcription

Comment peut on aller plus loin dans l'étude? Etudes in vivo... Intégrines... Autres facteurs de transcription... Pathologies associées à un defaut de laminine...

TD 1

Rappel Migration Differenciation

Rôle important de la Matrice extracellulaire dans la différenciation intestinale. Mais elle n’est certainement pas le seul stimulus de différenciation Autre hypothèse: le processus est dirigé par une horloge moléculaire intracellulaire.

p27(Kip1) is an inducer of intestinal epithelial cell differentiation   p27(Kip1) is an inducer of intestinal epithelial cell differentiation. Quaroni A, Tian JQ, Seth P, Ap Rhys C. Section of Physiology, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Oct;279(4):C1045-57.

balance prolifération différenciation

Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI) Il en existe plusieurs: p27 Kip1 (p27), p21 Cip1/WAF1 (p21), p16… Correlation entre l’expression de cki et le degré de différenciation. surexpression de p21 dans les cellules intestinales différenciées p27 dans les kératynocytes: l’augmentation de l’expression de p27 est concomittant avec la différenciation. Un oligonucléotide antisens de p27 inhibe la differenciation. Rôle de p27 dans la différenciation des cellules intestinales?

Méthode Utilisation de la lignée HIEC6: cellules issues de cryptes Surexpression par infection de: Vecteur seul Adnull p16 Adp16 p21 Adp21 p27 Adp27 Analyse de la prolifération, des différentes phases du cycle cellulaire, de la morphologie des cellules, de l’expression de marqueurs de différenciation

Contrôle de l’expression des ckis Les cellules sont infectées à différentes concentrations d’adenovirus. Apres 24 heures analyse des differentes protéines par Western blot

Contrôle de l’expression des ckis Analyse par immunocytochimie de l’expression des cki

Conclusions L’infection des cellules par l’adenovirus + cDNA exogène induit l’expression des ckis La surexpression de P21 entraine l’expression de P27 (P27 sous le contrôle de p21?)

Cki et prolifération A:1 jour après infection B: effet dose de l’adenovirus sur la prolifératiopn C: étude cinétique

Brdu (bromodeoxyuridine) Ac X-Brdu Ac X-Ac X-Brdu

Cki et prolifération A:1 jour après infection B: effet dose de l’adenovirus sur la prolifératiopn C: étude cinétique

Conclusions P16, P21 et P27 inhibent la prolifération de facon dose-dépendante. Plus d’éfficacité pour P27, p21 puis P16 L’effet de P27 est irreversible

Surexpression des cki et cycle cellulaire Pic G1 Nombre de cellules Pic G2-S-M Intensité de fluorescence Contenu en ADN

Cki et cycle cellulaire

Conclusions P16, P21 et P27 augmentent la quantité des cellules en phase G0/G1et diminue le nombre de cellules en phase S

Cki et morphologie

Conclusions L’expression des CKI entraine: p16: cellules polygonales mais pas de microvillosité p27: cellules polygonales avec presence de nombreuses microvillosités. p21: 20-40% des cellules sont polygonales avec des microvillosité. p27 induit une differenciation morphologique

cki et expression de la DPP IV Proteine ARNm Activité enzymatique

cki et expression de la DPP IV

Conclusions p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de la DPPIV fonctionnelle. Localisation a la membrane plasmique. Polarisation??????

Comment faire pour déterminer si l’expression de la DPPIV est polarisée?

cki et expression de l’APN

cki et expression de l’APN

Conclusions p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de l’APN.

En conclusion

Autres systèmes cellulaires... Premier article montrant le rôle de p27 dans la différenciation des cellules epithéliales. Et en 2005? Même rôle dans les cellules épithéliales bronchiques Autres systèmes cellulaires...

Comment peut on aller plus loin dans l'étude? In vivo…Il existe d’autres facteurs que les CKI. Souris KO pour P21… l’intestin est normal. Cancer: dans les carcinomes la P27 est souvent sous-exprimée. Cette sous expression est associée à une augmentation de l’agressivité des cancers. Mêmes résultats pour prostate et estomac.

Pourquoi la surexpression de P21 induit la différenciation