Biotechnologies végétales Marie-Françoise Niogret Maria Manzanares Antoine Gravot UMR 118 Amélioration des Plantes et Biotechnologies Végétales – INRA-Agrocampus Ouest-Université de Rennes 1 2011-2012 S7 : Technologie et biotechnologie végétales

? Mais comment en est-on arrivé à des définitions aussi sibyllines ? S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologie : Définition OCDE (2005) L’application de la science et de la technologie à des organismes vivants, de même qu’à ses composantes, produits et modélisations, pour modifier des matériaux vivants ou non-vivants aux fins de la production de connaissances, de biens et de services. ? Mais comment en est-on arrivé à des définitions aussi sibyllines ?

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies «l’application des principes scientifiques et de l'ingénierie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens et services » (OCDE)  technologies de bioconversion Pour démarrer cette UE Biotechnologie végétales, il importe à mon avis de se pencher au préalable sur les différentes définitions des biotechnologies qui ont été proposées en insistant sur la diversité actuelle des sens qui sont placés sous ce terme aujourd’hui. Historiquement, les premières définitions de la biotechnologie sont issues de l’univers du génie des procédés, une science appliquée ayant pour objet l’optimisation et le dimensionnement de procédés de production, initialement dans l’industrie chimique  le terme Biotechnologie est proposé par le Hongrois Ereky début du XXe siècle pour désigner l’utilisation de microorganismes comme facteurs de conversion de la matière première dans un univers d’industrie chimique (ex: production de solvants en fermenteurs, mais également brasserie). L’idée générale à ces définitions est de traiter des matières par des agents biologiques pour produire des biens ou des services. Définition simple qui se comprend aisément dans son contexte industriel. L’outil emblématique des biotechnologies est alors le fermenteur. Dans le domaine végétal, ces aspects ont été un peu développés à partir des années 80 pour la production de composés pharmaceutiques. On utilise souvent le terme de bioréacteur pour les cultures de cellules eucaryotes. Ces définitions sont encore complètement d’actualité dans le domaine de la microbiologie industrielle. Un exemple concret est la production industrielle de glutamate par Corynebacterium glutamicum. De nombreuses définitions plus récentes ont cherché à décrire toutes les branches des biotechnologies en se basant sur cette définition initiale, à mon sens donnant naissance souvent à des choses un peu obscures : Définition OCDE La biotechnologie est définie par l’utilisation de techniques impliquant du matériel vivant : - servant à modifier des organismes vivants existants ou des parties de ceux-ci ou ; - servant à transformer du matériel, d’origine vivante ou non, par l’utilisation de procédés impliquant des organismes vivants. et ayant pour objectif de produire de nouvelles connaissances (scientifiques) ou de développer de nouveaux produits ou procédés. Fermenteurs Bioréacteurs

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales « Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale» www.srpv-bretagne.com Haplodiploïdisation Culture de méristèmes Micropropagation Sauvetage d’embryons Fusion de protoplastes Création de variabilité Banque de germoplasmes … Si maintenant on se penche plus spécifiquement sur le domaine des biotechnologies végétales, on s’aperçoit rapidement que les biotechnologies couvrent tout un champ de techniques spécifiques aux plantes et aux filières associées, n’impliquant pas forcément la transgénèse. Parmi elles, certaines sont utilisées depuis de nombreuses années en routine dans la plupart des organismes impliqués dans la production et la conservation de semences. On peut citer par exemple : L’haplodiploïdisation L’assainissement de variétés par culture de méristèmes La micropropagation Le sauvetage d’embryons La fusion de protoplastes La création de variabilité par mutagénèse chimique Beaucoup d’organismes et de petites PME – qui n’utilisent pas la transgénèse - définissent les biotechnologies végétales comme l’ensemble de ces techniques qu’elles utilisent au quotidien. Exemple : Bretagne Biotechnologies Végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés » Le développement des technologies de l’ADN recombinant à partir des années 70 a conduit à l’utilisation toujours dans des contextes de fermentation de microorganismes génétiquement modifiés. Rapidement cependant la transgénèse a trouvé des applications en dehors de l’univers du génie des procédés (animaux et plantes transgéniques…), conduisant à placer la transgénèse au cœur de la notion de biotechnologie. On peut identifier alors une « famille de définitions » de tradition qu’on pourrait qualifier d’américaine. Il est notable que Le protocole de Carthagène (signé en 2000) a proposé assez récemment une définition restrictive des biotechnologies modernes de la façon suivante A De l'application de techniques in vitro aux acides nucléiques, y compris la recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et l'introduction directe d'acides nucléiques dans des cellules ou organites, B De la fusion cellulaire d'organismes n'appartenant pas à une même famille taxonomique A titre d’exemple, le journal phare « Nature Biotechnology » traite aujourd’hui quasiment exclusivement de travaux faisant appel à la transgénèse, quoi que les innovations du génie des procédés dans le contexte de la valorisation énergétique de la biomasse s’y sont taillé récemment des tribunes remarquables. “Biotechnologies modernes” (Protocole de Carthagène)

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Développement et application d’outils moléculaires dans différents domaines relatifs à l’agronomie et la médecine » Science Museum/Science & Society Picture Library Enfin, de très nombreux outils moléculaires faisant appel au séquençage sont aujourd’hui au cœur de la sélection variétale. On pense évidemment aux marqueurs moléculaires de sélection, mais l’aboutissement des projets de séquençage des génomes permettent aujourd’hui des approches extrêmement prometteuses ne faisant pas forcément appel à la transgénèse. De nombreux instituts tels que le National Center for Biotechnology Information revendiquent l’idée que le séquençage des génomes et que tout le travail de génomique fonctionnelle est une activité de biotechnologie.

Meristem Therapeutics Bretagne Biotechnologies Végétales S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale» Meristem Therapeutics Un aspect non négligeable des biotechnologies réside dans le coût de R&D qu’elles nécessitent, coût plutôt inédit en particulier dans les domaines de l’agriculture. Ces coûts ne peuvent être le plus souvent supportés que par des entreprises ayant une large ambition commerciale. Cet état de fait a conduit certains auteurs (cf G.Courtouly) à inclure ces aspects d’investissements et d’ambition commerciale dans une définition moderne intéressante des biotechnologies : Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale (G. Courtouly) Bretagne Biotechnologies Végétales

Définitions Issues du génie des procédés (« école allemande ») S7 : Technologie et biotechnologie végétales Définitions Issues du génie des procédés (« école allemande ») Définition historique (Karl Ereky), début XXème Technologies de la biotransformation Mots clés : génie des procédés, production industrielle Issues du génie génétique (« école américaine ») Depuis les années 70 « Utilisation des techniques de l’ADN recombinant » Mots clés : ADN recombinant, protéines hétérologues, organismes génétiquement modifiés Notion de « Biotechnologie moderne » du Protocole de Carthagène Plaçant au premier plan l’ampleur des investissements R&D et des débouchés industriels et commerciaux Définitions concernant spécifiquement le végétal et les techniques de culture in vitro Plus récemment : définitions incluant les approches de génomique

Et une définition plus simple que je vous propose: S7 : Technologie et biotechnologie végétales Definition proposée par l’Association Française des Biotechnologies Végétales : Les biotechnologies végétales sont des technologies qui recouvrent toutes les interventions en laboratoire sur les organes, les tissus, les cellules ou l’ADN des végétaux, soit pour mieux maîtriser ou accélérer leur production, soit pour améliorer leurs caractéristiques, au service de la recherche, de l’agriculture ou de productions industrielles. Et une définition plus simple que je vous propose: Ensemble de pratiques faisant appel aux cultures in vitro de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale La question n’est pas ici de trancher pour savoir quelle est la définition correcte, invalidant les autres, mais d’être avant tout capable d’identifier ce à quoi font référence les uns et les autres lorsqu’ils parlent de biotechnologie végétale. Dans les enseignements qui vont suivre nous essayerons d’avoir une approche assez transversale et nous proposons la définition suivante : Biotechnologies végétales : Ensemble de pratiques faisant appel aux cultures in vitro de plantes et/ou aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale

Cours TD/contrôle continu Cultures in vitro A. Gravot S7 : Technologie et biotechnologie végétales Cours Cultures in vitro A. Gravot Marqueurs moléculaires M.Manzanares Transgénèse M-F.Niogret Applications non-alimentaires A.Gravot TD/contrôle continu Analyse d’articles par binômes Synthèse écrite 500 mots pour le lundi 3 octobre + diaporama Conseils personnalisés pour améliorer le diaporama le 7 octobre 12 et 13 octobre: soutenances orales : 12 minutes T-DNA & données de transcriptome (par binôme) 2 TD en salle bioinformatique Rapport à remettre pour le 6 décembre TP en septembre B-A-BA de la manipulation d’explants et de la préparation de milieux de culture. Préparation et utilisation de protoplastes Visite de l’IGEPP (INRA Le Rheu): Haplodiploïdisation & transgénèse Colza + Plateau de génotypage

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Totipotence de la cellule végétale S7 : Technologie et biotechnologie végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation (site du GNIS)

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Gretchen Vogel, 2005

Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes S7 : Technologie et biotechnologie végétales Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes Contexte théorique au début du XXème siècle: Théorie cellulaire (Schleiden et Schwann) Microbiologie et biochimie Comment étudier le comportement de cellules isolées ? Cultures en conditions stériles Caractérisation de substances de croissance

G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale Deux idées importantes : la culture de cellules isolées constituerait potentiellement un modèle de recherche maintien en vie de cellules isolées Pas de multiplication cellulaire on peut potentiellement régénérer une plante entière à partir d’une cellule isolée  totipotence Échec (mauvais choix d’explants, méconnaissance des substances de croissance) http://users.ugent.be/~pdebergh/his/his2az1.htm

Émergence des techniques de culture S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Émergence des techniques de culture Haberlandt (1902) : concept de totipotence White (1934) : culture in vitro de racines de tomates Gautheret (1935) : utilisation d’auxine pour cultiver du cambium de saule 1939 : 1ère culture indéfinie de cals de carotte https://www2.carolina.com La culture de tissus est possible en utilisant des substances de croissance et/ou des tissus méristématiques

Émergence des techniques de culture S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Émergence des techniques de culture Braun (1941) : travaux sur le crown gall Miller (1955) : cytokinines Murashige et Skoog : mise au point de milieux de culture efficaces contenant des cytokinines et des auxines Croissance in vitro des tumeurs sans ajout d’hormones Organogénèse & callogénèse

“La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation” S7 : Technologie et biotechnologie végétales “La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation” Sugimoto 2010 Dev Cell Birnbaum 2008 Cell

Confirmation des hypothèses d’Haberlandt S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Confirmation des hypothèses d’Haberlandt 1956 (Muir) suspensions cellulaires 1958 (Reinart et Stewart) Embryogenèse somatique chez la carotte

Confirmation des hypothèses de Haberlandt S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Confirmation des hypothèses de Haberlandt 1960 Production fiable de protoplastes par digestion enzymatique (Cocking) 1971 (Nagata et Takabe) Régénération d’un plant entier à partir d’un protoplaste

Développements : des outils agronomiques S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : des outils agronomiques 1965 (Morel) Germination et micropropagation in vitro des orchidées 1967 (JP Bourgin & JP Nitsch) : tabacs haploïdes à partir d’anthères 1973 : hybride issu d’une fusion de protoplastes

Développements : production de métabolites secondaires S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : production de métabolites secondaires 1977 : culture de cellules de tabac dans un réacteur de 20 000 litres 1983 (Mitsui Petrochemical) : production industrielle d’un pigment: la shikonine 1997 L’entreprise Samyang Genex (Daejeon, Corée) produit un anticancéreux, le Genexol, à partir de cultures in vitro de Taxus

Développements : la transgenèse S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : la transgenèse Marc Van Montagu (1983) : tabac résistant à la kanamycine 1994 : Flavr Savr (Calgene, antisensage d’une polygalacturonase) 1996 : maïs transgénique commercialisé aux USA

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Sussex, Plant Cell 2008

Conclusions Problématique initiale : S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Conclusions Problématique initiale : recherche d’un modèle de cellules isolées démonstration de la totipotence des cellules végétales Identification du rôle des substances de croissance Mise au point de nombreuses techniques Transgénèse

Revenons sur le phénomène de totipotence… S7 : Technologie et biotechnologie végétales Revenons sur le phénomène de totipotence… Les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation (site du GNIS)

Embryogenèse / Organogénèse S7 : Technologie et biotechnologie végétales Embryogénèse Régénération d’organes et de tissus à partir de cellules somatiques ou de cellules « indifférentiées » à partir de cultures de cellules “indifférentiées” à partir de cellules somatiques Garces et al. PNAS 2007 Birnbaum 2008 Cell Sena & Birnbaum 2010 Birnbaum 2008 Cell

Des cellules plus ou moins totipotentes S7 : Technologie et biotechnologie végétales Des cellules plus ou moins totipotentes Les méristèmes : un réservoir de cellules totipotentes Les autres types cellulaires : une totipotence plus ou moins facile à exprimer Utilisation de substances de croissance exogènes Régénération directe Régénération en passant par un stade de cal Variabilité interspécifique

Principales méthodes de micropropagation Culture de méristème Meristème Plantules Apex caulinaire Tige feuillée Enracinement Morphogenèse directe Caulogenèse directe Embryogenèse somatique directe Semences artificielles Morphogenèse indirecte Callogenèse cal Suspensions cellulaires Caulogenèse indirecte Embryogenèse somatique indirecte Explants divers (racines, tige, feuilles…) Nœud D’après Lindsey et Jones 1989

“La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation” (?) S7 : Technologie et biotechnologie végétales “La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation” (?) Sugimoto 2010 Dev Cell Birnbaum 2008 Cell

Comprendre la nature des cellules souches S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre la nature des cellules souches Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

Comprendre les mécanismes de dédifférenciation S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Modulation de l’expression génétique via des mécanismes épigénétiques Reconformation de la chromatine Modification des histones Méthylation de l’ADN

Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle S7 : Technologie et biotechnologie végétales Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle

Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle S7 : Technologie et biotechnologie végétales Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle

Kaoru Sugimoto, Yuling Jiao, and Elliot M. Meyerowitz S7 : Technologie et biotechnologie végétales CONCLUSION: In this study, we show that callus formation from multiple organs is not a process of reprogramming to an undifferentiated state, but rather the differentiation of pericycle-like cells present in the organ toward root meristem-like tissue. In this case, the pericyle-like cells are functionally analogous to animal tissue stem cells, which are found in many tissues throughout the body and can divide and differentiate into specialized types of cells. This leaves open the question how root meristem-like callus tissue has the ability to form aerial shoots in the next stage of the regeneration process Kaoru Sugimoto, Yuling Jiao, and Elliot M. Meyerowitz