Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire OPTION CANCEROLOGIE 29 septembre 2010 L.Mauvieux

Plan du cours Introduction Mécanismes oncogéniques dans les LAM Translocation et oncogénèse des LAM Epigénétique et LAM Questions sans réponses…

Les leucémies aigues myéloblastiques Mécanismes oncogènes des LAM Introduction Les leucémies aigues myéloblastiques Mécanismes oncogènes des LAM

Différenciation normale Cellule souche Moelle Différenciation lymphoïde Différenciation myéloïde Précurseurs Précurseurs Éléments matures Éléments matures Sang

LEUCEMIES AIGUES Cellule souche Leucémie aiguë lymphoblastique myéloblastique Moelle Différenciation lymphoïde Différenciation myéloïde Précurseurs Précurseurs Sang Éléments matures Éléments matures Éléments immatures Éléments immatures

Leucémies aigues myéloblastiques (LAM) Définition OMS: expansion clonale de cellules blastiques myéloïdes dans la moelle osseuse, le sang ou autres tissus Maladies génétiquement et phénotypiquement hétérogènes Incidence 2 à 3/100000 adultes dans pays industrialisés (maximum US, Australie, Europe de l’ouest) Age moyen 65 ans, peu fréquent chez les enfants LAM = cancer = mutations Maladie hématologique hétérogène: Morphologiquement Génétiquement

Maladie hématologique génétiquement hétérogène: mutations somatiques, clonales de la CSH Pas de transmission à la descendance (rarissime) Plusieurs mutations nécessaires, de 3 à 20? Mutations ponctuelles Amplifications, délétions Réarrangements chromosomiques Nombreux mécanismes oncogéniques découverts= espoir de thérapeutiques spécifiques

TWO-HIT MODEL (Gilliland) 1) Anomalies génétiques portant sur la prolifération et la survie des progéniteurs Activation de voies de transduction Mutations activatrices de: Ras, c-kit, FLT3 Mutations inhibant NF-1 Inhibition de la phosphatase hématopoïétique SHP-2 (voie JAK-STAT) Inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (p15; p16) (méthylation) identifiées dans 50% des LAM souvent exclusives les unes des autres

2) Anomalies agissant sur la différenciation hématopoïétique impliquant le plus souvent des facteurs de transcription ou des coactivateurs importants pour l’hématopoïèse normale Core binding factor (CBF) Récepteur de l’acide rétinoïque MLL (Trithorax homolog) =>Coopération des deux groupes pour déclencher la pathologie Souris transgénique PML-RARA: LAM en 6 mois (15-30%) Souris transgénique FLT3-ID: lymphome T en 6 mois Souris reconstituée avec une moelle FLT3-ID + PML-RARA: 100% de pénétrance avec délai raccourci bon pronostic mauvais pronostic

Coopération entre les mutations dans la pathogénèse des LAM Anomalies de Type I Anomales de Type II FLT3-ITD FLT3-TKD KIT RAS PTPN11 JAK2 PML-RARA RUNX1-RUNX1TA CBFB-MYH11 MLL fusions CEBPa NPM1 Avantage prolifératif Altération de la différenciation Et de l’apoptose

Leucémogénèse: processus multi étapes(3) réalité + complexe blocage de différenciation avantage prolifératif CBF RARα Réarr MLL Co activateurs C/EBP bcr-abl TEL-PDGFRβ RAS FLT3 autres TK activées LEUCEMIE AIGUE auto-renouvellement autres… WNT Notch Bmi-1 Hox apoptose? … ?

LAM : Maladie de la cellule souche, multi-étapes Rares familles avec mutations du gène AML1: leucémie tardive (anomalies chromosomiques supplémentaires dans les cellules hématopoïétiques) détection de translocations chromosomiques associées aux leucémies in utero [t(4;11)], la pathologie apparaissant plus tard dans la vie sang de cordon ombilical: transcrits de fusion TEL–AML1 et AML1–ETO 100 fois plus fréquents que la prévalence de la leucémie aiguë correspondante dans la population Existence de pathologies évoluant progressivement vers la leucémie aigue myélolastique Owen CJ, Blood. 2008 Aug 21

Anomalies géniques « Bruit » chromosomique (aléatoire)? Anomalies primaires précoces confère le caractère oncogénique Anomalies secondaires au cours de l ’évolution de la maladie influe sur la progression modifie phénotype tumoral

ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN) Hyperdiploidie 50-65 chromosomes Hypodiploidie 26-34 chromosomes

CONSEQUENCES MOLECULAIRES DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES

Caryotype (cytogénétique conventionelle)

IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1

Peinture chromosomique

Multi-FISH

Gènes impliqués dans les translocations Ce sont très souvent des facteurs de transcription qui interviennent dans la « maintenance » des CSH et dans l’hématopoïèse précoce (oncogènes) Cheminement de la découverte des fonctions de ces oncogènes: 1 - d’abord par la compréhension de la pathologie maligne: les leucémies 2 - Certaines anomalies chromosomiques récurrentes de ces leucémies 3 – des modèles animaux modifiés (Tg; KO) 1 - d’abord par la compréhension de la pathologie maligne: les leucémies sont précisément des maladies caractérisées par des perturbations de la différenciation et de la maturation des cellules souches. 2 - Certaines anomalies chromosomiques récurrentes de ces leucémies correspondent à l’altération des structures et fonctions de facteurs de transcription intervenant à de multiples niveaux de l’hématopoïèse; une fois identifiés grâce à la pathologie, leur rôle physiologique a été précisé 3 – des modèles animaux déficients, hétérozygotes (+/-) ou homozygotes (-/-) ont été obtenus par transgénèse et /ou recombinaison, qui ont confirmé les rôles respectifs de ces facteurs de transcription qui interviennent (on retrouve de très grandes homologies ou des identités entre notre espèce et certains animaux de laboratoire, la souris particulièrement)

Anomalies chromosomiques = guide Permet le clonage des gènes responsables Compréhension de la physiopathologie Marqueur de clonalité / Facteur pronostic Cible thérapeutique potentielle molécule spécifique éventuelle (acide rétinoique) Adaptation du traitement en fonction de critères pronostics associés aux différentes anomalies

Oncogénèse des LAM: Cibles multiples ●Récepteurs -FLT3 -PML-RARA                  ● Activation gènes de la différenciation: -AML1 -RARA ●Transduction du signal -Ras ●Facteurs de transcription -AML1, MYH11 -ETV6 (TEL) -MLL… Modification épigénétiques ADN, histones, miRNA ●Cycle cellulaire -p27 -p15 Noyau Surveillance intégrité ADN p53

LAM et translocations chromosomiques Elles sont réciproques, stables et équilibrées Entraînent la fabrication d’un transcrit de fusion et d’une protéine chimérique avec de nouvelles propriétés qui va interférer avec la maturation myéloide récurrentes Particularité: dans les LAM qui apparaissent après un traitement avec des agents alkylants, s’accompagnent de délétions de chromosomes 5 et 7

Mécanismes oncogènes principaux dans les LAM Peu de mutations prédisposantes transmissibles ont été trouvées Translocations chromosomiques réciproques nombreuses: Découverte des gènes impliqués Cassures de l’ADN: au hasard? Rôle de la structure chromatinienne: « accessibilité » Sites sensibles spécifiques: ADN topoisomérases Sites hypersensibles à la DNase Séquences Alu Mutations de gènes (FLT3, NPM1), fréquentes en l’absence de translocations Classification des LAM (OMS, 2001, 2008) Distingue les LAM avec anomalies chromosomiques récurrentes des autres

Analyse génomique du locus 11q23 (gène MLL) Impliqué dans 15% des LAM > 70 translocations, >50 gènes partenaires différents décrits Dans la très grande majorité corrélée à un mauvais pronostic de la maladie

MLL (Mixed lineage leukemia) Zn-finger SLN Zn-finger Bromo FY TAD SET ADN chromatine CBP méthylation 2 domaines de fixation à l’ADN 1 domaine méthyl-transférasse Un bromodomaine (fixation protéines) 1 domaine de transactivation (fixation CBP, activation HOX) 1 domaine de type SET (homologies trithorax drosophile+++) Activité methyltransferase , notamment sur gènes HOX cruciaux pour le développement chromatine

1-Analyse génomique des points de cassure des translocations (1) Les points de cassure ne sont pas distribués au hasard dans le gène Situés sur des « clusters » introniques (BCRs) Des biais de localisation ont été montrés: BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulte Entre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie => mécanismes probablement différents!!!

BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulte Entre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie => mécanismes probablement différents!!!

2-Analyse des séquences nucléotidiques aux points de cassure des translocations Séquences aux points de cassure: très peu d’homologie de séquence (parfois séquences Alu- discuté) Les points de cassure colocalisent avec des éléments de la structure chromatinienne: Sites de clivage de la topoisomérases II Sites hypersensibles à la DNase 1 SARs (scaffold attachment régions) => impliquées dans la survenue des translocations

MLL, topoisomérases et translocations La topoisomérase II catalyse la relaxation des doubles brins d’ADN : « Nick » de 4 bases au niveau de son site de fixation Permet le passage d’une seconde hélice d’ADN Réparation de l’ADN Essentielle dans: Condensation chromatinienne Transcription, réplication, apoptose… Drogues inhibant la topoisomérase Stabilisation du complexe de clivage (poison) Inhibition catalytique de l’enzyme Aliments contiennent des éléments interagissant avec la topoII (flavonoïdes, caféine, phénols des plantes): Ex: café, pommes, oignons, soja, fruits rouges, thé, chocolat…

Gilliland, D. G. et al. Hematology;2004:80-97 Modèle de lésions induites par l’ADN topoisomérase II dans la survenue de translocation impliquant MLL Gilliland, D. G. et al. Hematology;2004:80-97

Gene MLL – chromosome 11q23 BamH1

Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(4;11) Lovett, Brian D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9802-9807 Autoradiographs of cleavage products after 10 min incubation of 25 ng (30 000 c.p.m.) singly 5' end-labeled DNA with 147 nM human DNA topoisomerase II      

Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(9;11) Oncogene (2003) 22, 8448–8459 Ryan J Whitmarsh et al.

Éléments chromatiniens impliqués dans les translocations Beaucoup de sites HS Dnase sont associés avec: Éléments génomiques régulateurs de la transcription SARS Les SARS définissent les sites d’attachement dans la matrice nucléaire des boucles de l’ADN pendant l’interphase ou la métaphase Zones de fragilité liée au propriétés de déroulement de l’ADN de certaines des protéines qui les composent

Facteur de transcription dimérique: -CBFa: AML1 (RUNX1) -CBFb: MYH11 2ième exemple: Facteurs de transcription : CBFs (core binding factors) et LAM Facteur de transcription dimérique: -CBFa: AML1 (RUNX1) -CBFb: MYH11

1) Core binding factors (CBFs) dans les LAM CBF est un facteur de transcription hétérodimérique constitué de: CBFa =AML1 = RUNX1 (21q22.3) CBFb (16q22.1) Rôle majeur dans l’hématopoïèse: Impliqués dans des translocations récurrentes des LAM: t(8;21)(q22;q22)  ETO-AML1 (10 à 15% des LAM) t(3;21)(q26;q22)  AML1-EVI1 (<1%) inv16(p11;q22)  CBFb-MYH11 (10% des LAM) Sans compter t(12;21) TEL-AML1 dans 30% des LAL de l’enfant Mutations ponctuelles de AML1

Conséquences des anomalies CBF Souris KO CBFb ou AML1: mort à J11.5 du développement pas d’hématopoïèse définitive Ces trois translocations inhibent la fonction normale de CBF, les transcrits chimériques pouvant: Recruter des hitones déacétylases (HDAC) Des co-represseurs (NCOR1, NCOR2, Sin3A En recrutant des méthyl transférases Souris Transgénique AML1-ETO: effet « immortalisant » des progéniteurs Anomalies des CBFs associées à un pronostic favorable

Localisation des points de cassure dans RUNX1/AML1 35 patients avec t(8;21)- AML1 -ETO: point de cassure génomique dans l’intron 5 10 patients avec t(3;21) – AML1-EVI1: introns 5 et 7a TEL-AML1 : leucémies aiguës lymphoblastiques: point de cassure différent

Sites sensibles topoII - DNase gène AML1 Yanming Zhang, Janet D. Rowley. dna repair 5 ( 2 0 0 6 ) 1282–1297 Colocalisation des points de cassure Les sites topoisomérase II les sites hypersensibles à la Dnase I…

Niveau d’énergie libre ADN du gène AML1 …colocalisation des points de cassure avec le niveau d’énergie libre nécessaire pour dérouler l’ADN super-enroulé

Les zones d’énergie libre faible colocalisent avec les points de cassure dans: AML1, ETO mais aussi montré pour BCR, ABL, MLL Les sites de clivage topoII et l’energie libre les plus faibles sont probablement des sites vulnérables pour les cassures, réparées ensuite par des mécanismes de réparation « non homologue » (NHEJ: non-homologous end-joining)

Oncogénèse des LAM et Ligands des récepteurs aux hormones L’histoire d’un succès thérapeutique

Léucémies aigues promyélocytaires Translocations récurrentes du chr 17q21dans 5-8% des LAM Arrêt de maturation au stade promyélocytaire cassure dans le gène du récepteur à l’acide rétinoïque (RARA Les ligands de ce récepteur ont un rôle fondamental dans la différenciation de la lignée granuleuse

Structure et fonction des protéines partenaires 1- RAR (17q21) récepteur nucléaire de l’acide rétinoïque liaison à l’ADN (RARE) après hétérodimérisation avec un autre récepteur nucléaire RXR FT°, régulateur transcriptionnel « hormone-inductible » régulation de gènes cibles en présence d’AR rôle dans la maturation myéloïde 5’-AGGTCA (N)5 AGGTCA-3’ 3’-TCCAGT (N)5 TCCAGT-5’ activation transcriptionnelle AF-1 inconnu Coiled-coil domain A B C D E F Liaison ADN Fixation ligand Hétérodimérisation Activation transcriptionnelle AF-2 Liaison co-Act, co-R

Fonction physiologique de RAR (en absence d’acide rétinoïque) X A - dimérisation RAR-RXR RARE fixation sur seq régulatrices (RE) de gènes cibles SMRT HDAC - intervention de corépresseurs Ncor et SMRT qui recrutent des histones desacétylases (HDAC) DEACETYLATION REPRESSION de la TRANSCRIPTION (compaction chromatine) Compaction de la chromatine 46

DIFFERENCIATION MYELOIDE Fonction physiologique de RAR (en présence d’acide rétinoïque) - AR: liaison à RARα  détachement des corépresseurs et le recrutement de coactivateurs (SRC1, CBP) R X A SMRT RARE Ac. Rétinoïque (doses physiologiques) HAT - Recrutement d’ histones acétyltransférases (HAT) Ac ACETYLATION ACTIVATION de la TRANSCRIPTION (ouverture chromatine) SRC-1 DIFFERENCIATION MYELOIDE

2- PML (15q22) fonctions mal connues effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques => contrôle de la prolifération et de la survie cellulaire localisation nucléoplasmique et corps nucléaires ( association à d’autres protéines : CBP, Daxx, ..) CBP: favorise acétylation des histones activ° transcription l’interaction CBP-PML peut expliquer les effets modulateurs de PML sur la transcription - Daxx : voie apoptotique - PML-/-: aN de la différenciation domaine de dimérisation

D- Protéine de fusion X-RAR PML (15q22) Promyelocytic Leukemia RAR (17q21) PLZF (11q23) Promyelocytic Leukemia Zinc Finger NMP (5q35) Nucleophosmine N/RAR NuMA (11q13) Nuclear Matrix Associated fig. 3

Protéine de fusion PML-RAR 1- structure Maintien des domaines importants de chacun des partenaires: - PML: motif RBCC (homodimérisation et interaction protéine-protéine) - RAR: fixation ADN, activation transcription en présence ligand, hétérodimérisation RXR RAR PML B C D E F bcr 1 (L type) 3 4 5 6 3 bcr 2 (V type) 3 4 5 6 3 bcr 3 (S type) 3 3 3 transcripts majeurs PML/RAR

REPRESSION de la TRANSCRIPTION (compaction chromatine) Protéine de fusion PML-RAR 2- conséquences fonctionnelles : modification fonction RAR - PML-RAR: formation hétérodimères RXR formation homodimères PML-RAR - PML-RAR  - RAR: affinité pour les corépresseurs > RXR,  liaison plus forte avec N-coR et SMRT  recrutement HDAC  effet dominant négatif  répression de transcription aux doses physiologiques d’AR DEACETYLATION REPRESSION de la TRANSCRIPTION (compaction chromatine) SMRT Ac. Rétinoïque (doses physiologiques) HDAC R A P M L RARE

ACTIVATION de la TRANSCRIPTION (ouverture chromatine) Protéine de fusion PML-RAR 3- impact thérapeutique : effet de doses pharmacologiques d’AR - affinité coR > pour X-RAR - déplacement courbe d’activation gènes cibles par l’AR vers des C° + fortes doses pharmacologiques d’AR (ATRA): détachement coR et HDAC  recrutement HAT  reprise de la différenciation RARE SMRT Ac. Rétinoïque (doses pharmacologiques) R A P M L Ac ACETYLATION ACTIVATION de la TRANSCRIPTION (ouverture chromatine) SRC-1 HAT REPRISE de la DIFFERENCIATION MYELOÏDE

Protéine de fusion PML-RAR 4- conséquences fonctionnelles : modification fonction PML PML-RAR : effet dominant négatif sur fonction de PML ? 4 membres de la même famille impliqués ds protéines de fusion oncogène  rôle propre de PML ds leucémogénèse ? PML: rôle antiprolifératif et pro-apoptotique PML-RAR: délocalisation de PML et de ses protéines partenaires (CBP et Daxx) en DH des corps nucléaires. délocalisation dysfonctionnement ? - blocage effet antiprolifératif et apoptose  prolifération cellulaire?

Autres protéines de fusion X-RAR mécanisme d’action commun: effet dominant négatif de la protéine chimérique. blocage de la différenciation myéloïde effet thérapeutique dépendant de la nature du produit de fusion: AR efficace sur NPM-RAR et sur NuMA-RAR aucun effet sur PLZF-RAR (PLZF :domaine suppl d’intéraction avec co-R, insensible à action AR) AsO3 semble avoir un effet propre sur PML (relocalisation ds CN)

Modifications épigénétiques Méthylation de l’ADN Modification des histones: Acetylation Méthylation Ubiquitination…. MicroRNA (miRNA)

miRNA Niveau supplémentaire de régulation cellulaire Impliqués dans l’apoptose, la differentiation, la prolifération cellulaire Altération des miRNA impliqués dans de nombreux cancers dont les LAM ex mir-17-92 cluster (oncogène) -mir 155

miR-17-92 cluster Polycistron sur le chr 13q31 contenant 7 micro-RNA différents Impliqués dans différents cancers (lymphome, prostate, colon, poumon…) sa transduction entraîne un augmentation de la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques chez la souris

miR-155 Rôle important dans la mégacaryopoïèse, l’erythropoièse, la lymphopoïèse Souris transgéniques miR-155: prolifération lymphoïde B Surexprimé dans les LAM qui présentent une différenciation monocytaire

miRNA et leucémies

Nombreuses cibles potentielles médicamenteuses

Conclusions LAM: complexité et hétérogéneité des mécanismes de l’oncogénèse Quel est l’ordre de survenue de ces anomalies? Comment les événements ont conduit à la survenue de la leucémie? Dans quelles cellules surviennent les anomalies génétiques: Cellules souches leucémiques?

La cellule souche leucémique (CSL) Toutes les cellules leucémiques ne sont pas en cycle (1970, Clarkson) Une fraction minoritaire CD34+ CD38- isolées de LAM peut donner des LAM dans des modèles de transplantation multiple Expriment des antigènes différents de la CSH normales Il existe des arguments en faveur: De cellules souches primitives leucémiques De progéniteurs ayant ré-acquis des propriétés d’auto-renouvellement De cellules intermédiaires Rôle de l’environnement probable (réactions immunes, infections…)

Mutations ponctuelles et leucémies aigues myéloblastiques Impliquant la transduction du signal: exemples: FLT3 RAS NPM1

FLT3 receptor Récepteur Mb à activité Tyr kinase exprimé à un haut niveau dans les progéniteurs et dans les LAM fréquemment muté dans les LAM (35%) mutation ponctuelle D835 exon20: boucle d’activation du deuxième domaine tyrosine kinase de FLT3 Dans 15% des cas: duplication interne en tandem dans l’exon 14 (de quelques bases à >150 bp) Dans 20-25% des LAM, La duplication intercale un peptide dans la boucle d’activation: modification de la structure Toujours dans le cadre de lecture Activation constitutive de la kinase Parcells, B. W. et al. Stem Cells 2006;24:1174-1184

Activation de FMS-like tyrosine kinase-3 receptor (FLT-3) Parcells, B. W. et al. Stem Cells 2006;24:1174-1184

Mutations Ras Famille Ras: protéines associées à la membrane, régulant la transduction du signal secondaire à la fixation d’un ligand 3 types: N, K, H-Ras Les mutations de confèrent une activation constitutive de Ras qui reste lié au GTP

Mutations de Ras dans les LAM Détectées dans hémopathies myéloïdes (23%) Étude de 1107 patients (Bowe, Blood, 2005) Mutations de K-RAS: (exons 12): 11% (sur 1107 patients) Mutations de N-RAS (exons 12 et 13): 5% des patients Mutations de H-RAS Associées à certains types morphologiques: LAM myélomonocytaires Sur-représenté dans certains groupes cytogénétiques (t(15;17), inv16)) Peu d’influence sur la survie ou sur les rechutes, résistance au traitement…en analyse univariée ou multivariée

Mutations ponctuelles et LAM FLT3 RAS NPM1

Mutations de NPM1 NPM1 = nucléophosmine Localisée dans le nucléole, supposée être une protéine chaperon facilitant le transport de protéines ribosomales à travers la membrane nucléaire Cassure de NPM1 observée dans des LA promyélocytaires (NPM-RARA) et dans 8% des lymphomes non hodgkinien (NPM-ALK) Muté au niveau de l’exon 12 dans 35% des LAM de novo En l’absence d’anomalies de FLT3, les LAM avec mutation de NPM1 ont un meilleur pronostic. Les 2 types d’anomalies entraînent une altération de sa localisation dans la cellule, empêchant sa fonction normale La mutation de NPM1 est un facteur indépendant de bon pronostic dans les LAM

« signature » d’expression génique liée à la mutation de NPM1 Expression de nombreux gènes du développement HOX et CD34 Cette signature est prédictive de la mutation de NPM1 Verhaak et al, 2005