Transcriptome et immunologie Philippe Kastner

Transcriptome Ensemble des ARN messagers exprimées par un système biologique donné Le transcriptome est une mesure de l’état biologique du système Méthode d’analyse: puces à ADN (microarray)

Le principe des puces à ADN : l’hybridation moléculaire Hybridation entre 2 molécules d’ADN complémentaires Double hélice ADN dénaturé ADN accroché à un support = ADN CIBLE Gène 1 Gène 2 * Hybridation avec les ARN des cellules à étudier = SONDE FLUORESCENTE Dans les cellules étudiées : ARN 1 (produit par le Gène 1) présent ARN 2 (produit par le Gène 2) absent Méthode d’analyse de l’expression des gènes basée sur le principe de l’hybridation moléculaire

Qu’est-ce qu’un microarray ou une puce à ADN (DNA chip) ? C’est un matériau (généralement du verre, du plastique, autre) sur lequel on a fixé un très grand nombre d’acides nucléiques différents de manière covalente = ADN CIBLE Les différents acides nucléiques (= ADN CIBLE ) sont bien ordonnés sur le support (on sait précisément où se trouve chaque gène) > « microarray » = microréseau L’ARN ou l’ADN extrait des cellules ou tissus à analyser est rendu fluorescent ( = SONDE FLUORESCENTE ) et est hybridé sur cette cible Les hybrides formés par complémentarité des bases (ADN CIBLE / SONDE FLUORESCENTE) sont repérés par mesure de la fluorescence Plus la fluorescence est intense, plus un ARN est abondant ANALYSES QUANTITATIVES

Deux grand types de puces à ADN Affymetrix Puces sur lame Mode de Fabrication Qui les fabrique ? Photolithographie Affymetrix Dépôt avec un robot ou synthèse directe Fait maison ou achetable

Les puces à ADN Affymetrix

GeneChip® Probe Array

GeneChip® Probe Arrays * Hybridized Probe Cell GeneChip Probe Array Single stranded, fluorescently labeled DNA target Oligonucleotide probe 11µm 1.28cm Each probe cell or feature contains millions of copies of a specific oligonucleotide probe chips/wafer Over 1 million different probes complementary to genetic information of interest Image of Hybridized Probe Array

Probe Tiling Strategy Gene Expression (25-mer)

Affymetrix Experimental System Cells,tissues Reverse Transcription (oligodT linked to the sequence of the promoter of the RNA polymerase T7) Synthesis of the second strand of cDNA AAAA-T7 TTTT-T7 AAAA 5’ TTTT-T7 Total RNA In vitro transcription (Biotin-UTP, Biotin-CTP) B 1 puce Biotin-labeled cRNA transcript 1 image Fragment heat, Mg2+ Target Preparation RNA isolation is the first step. 1-2 hours The messenger RNA is then reverse transcribed into cDNA (we then go on to make the second strand of cDNA). 4 hours An in vitro transcription reaction using biotinylated nucleotides is then done to both amplify and label the transcripts. 4-6 hours These are then fragmented in order to get a more efficient hybridization (30-100 bases pairs is the goal). 1.0 hours The fragmented target is then hybridized overnight to a GeneChip expression array. 16 hours When washing and staining of the array is complete it can then be scanned. 1-2 hours Scanning B Washing & Staining Hybridization Streptavidin-Phycoerythrin Biotin - labeled cRNA fragments

Mesures obtenues par puces affy Average difference Σ (PM-MM) / N Absolute call (Present/Absent) Défini par le nombre de paires PM/MM ou PM>MM Autres méthodes de calcul des valeurs d’expression possibles

Les puces sur lame

2 types de puces Dépôt de micro-gouttes avec un robot - densité jusqu’à 30 000 sptots par lame - artisanale (variabilité) Synthèse directe densité jusqu’à 106 spots par lame - Puces commerciales (Agilent, Nimblegen, Applied)

Puce artisanale spottée Puce commerciale Agilent

Fluorescent labelling, Hybridization and Scanning Reverse Transcription : oligodT + dUTP-Cy3 TTTTTTTT AAAAAAAA RNA degradation mRNA ss cDNA Cells A Cells B AAAAAAAA mRNA Reverse Transcription : oligodT + dUTP-Cy5 Direct labeling TTTTTTTT AAAAAAAA RNA degradation TTTTTTTT ss cDNA 5  ’ microarray Cy3+Cy5 probe Hybridization Scanarray 4000 (Perkin Elmer) Scanning Cy3 and Cy5 images overlayed

Comment concevoir une expérience de microarrays ? But: déterminer les variations biologiques entre différents échantillons. Mais il faut distinguer celles-ci des variations liées à la technologie, ou à celles liées à la variabililé intrinsèque des échantillons

Thomas Hudson, Montreal Genome Center

Intensité croissante

Différences d’expression réelles ou artéfactuelle ? 6 échantillons: A1, A2, A3, B1, B2, B3 Microarray comprenant 20 000 gènes échelle d’expression: 1- 10000 Mesures pour un gène X A1 A2 A3 B1 B2 B3 25 30 35 55 50 66 Test t: p = 0,01 Pour combien de gènes une telle valeur peut-elle être obtenue par hasard ? (« false discovery rate », ou FDR)

Estimation du nombre de gènes différentiels « réels » Comparaison Nombre de gènes différentiels (Changement > 2x, p <0,01) (A1, A2, A3) vs (B1, B2, B3) 300 (A1, B2, A3) vs (B1, A2, B3) 150 (A1, B2, B3) vs (B1, A2, A3) 200 (A1, A2, B1) vs (B2, B3, A3) 100 La moitié des gènes différentiels est artéfactuelle ! Solutions: multiplier les réplicats augmenter la stringence des critères de sélection.

Combien de réplicats sont-ils nécessaires pour une expérience réussie ? variabilité Number of replicates Type of sample Cell lines Mouse cells Mouse organs Human cells Human tumors Interested by Big changes 2 2-3 3-4 5-6 >30 Small changes 4-5 10 10-15 >60

Deux grands types de méthodes de « clustering » Méthodes hiérarchique: génération d’un dendogramme (arbre) qui relie tous les gènes ou échantillons entre eux. Méthodes par partitionnement, qui divise les gènes en K classes ayant des profils similaires (K défini par l’utilisateur) - K-means - Self-organizing maps (SOM) - analyse par composantes principales (PCA)

Regroupement en fonction de profils d’expression similaires 700 gènes 1. Gènes Évolution temporelle de l’expression des gènes dans des fibroblastes humains stimulés par du sérum (Pat Brown, 1997) Visualisation d’une chorégraphie de l’expression génique dans le temps.

Regroupement en fonction de profils d’expression similaires 2. échantillons Different cell lines to be compared Genes belonging to one cluster Fold Changes 1 -2 -4 -6 +6 +4 +2

Méthodes par partitionnement (K-means, Fuzzy C-means, Self organizing maps) N expériences chaque gène est considéré comme un vecteur dans un espace de dimension N (coordonnées = valeurs d’expression dans chaque expérience) Partitionnement des gènes en K classes optimisées selon des critères de proximité des gènes dans l’espace vectoriel

Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes)

Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes) Ikaros bcat TelJak2 Tal-Lmo1

Visualisation des clusters FCM (4208 genes) B-catenin ICN1 Ikaros TelJak2 Tal-Lmo1

Applications des microarrays 1. Expression différentielle Question: pourquoi B est-il différent de A ? (KO vs WT; effet d’un traitement; sain vs malade, etc …) Comparaison de A et B 200 gènes différentiels !! Et ensuite ??? ….

Exemple d'application 1: Fonction du facteur de transcription AIRE dans les cellules épithéliales du thymus (Science 298, 1395-1401, 2002)

Problème: comment les lymphocytes T potentiellement autoréactifs contre des antigènes tissu-spécifiques sont-ils éliminés dans le thymus ? (tolérance centrale) Cellules épithéliales médullaires: expression "ectopique" de nombreux transcrits tissu-spécifique. Rôle dans la délétion clonale des lymphocytes T autoréactifs ? Aire: facteur de transcription muté dans le syndrome autoimmun poly-endocrine de type I. Autoimmunité contre de nombreux tissus

1. Fabrication d'un modèle de souris déficient pour Aire autoanticorps contre de nombreux tissus périphériques (rétine, glande salivaire, thyroide, etc..) 2. L'expression de Aire est restreinte au cellules épithéliales du thymus 3. Comparaison du transcriptome des cellules épithéliales thymiques de souris normales et mutantes

Comparaison du transcriptome des cellules épithéliales thymiques contrôle et déficientes pour AIRE diminution de l'expression de la plupart des gènes différentiels comparaison globale

La plupart des gènes différentiels sont des gènes spécifiques d'un tissu

Exemple 2: Lymphomes thymiques chez des souris mutantes pour le gène Ikaros Recherche de la voie moléculaire impliquée dans le développement de ces tumeurs par une analyse du transcriptome.

Conception expérimentale 6 IkL/L tumors 4 Tel-Jak2 tumors 5 non tumoral thymocytes Genes specifically deregulated in IkL/L tumors ?

Notch upregulation is associated with tumors lacking Ikaros IkL/L tumors IkL/L tumor TelJak2 tumors Hes1 Notch1 Deltex 1 pT Notch pathway signature

Applications des microarrays 2. Transcriptome comme mesure phénotypique d’un système biologique Concept: Profil apparenté de l’expression des gènes implique une similitude d’état biologique Application principale: classification des tumeurs

Signature transcriptomique Ensemble de gènes caractéristiques d’un état biologique donné Type cellulaire (ex: signature des pDCs) stimulation d’une voie moléculaire

Exemple 3: analyse de la signature de cellules dendritiques plasmacytoïdes Liu et al, Nature Immunol, 2004

Plasmacytoid DCs: innate viral sensors stimulating adative immune responses Plasma cell differentiation TLR7 (RNA) Th1 polarisation Virus sensors IFNa pDC NK cell cytotoxicity TLR9 (DNA) CD8+ T cell cytotoxicity Differentiation into APC Other roles: Tolerogenic function (induce T-reg activity) secretion of other signaling molecules (IL12, chemokines)

Comment les pDCs se développent-elles ? Des lignages de pDC séparés myéloïdes et lymphoîdes ? Des pDCs peuvent être produites à parftir de précurseurs « myéloïdes » ou « lymphoïdes » Les pDcs expriment certains gènes lymphoïdes (pTa, lambda5, Rag, SpiB) Les pDCs sont-elles apparentées aux DC conventionnelles ? Non: identification d’un progéniteur commun monocytes/cDC qui ne possède pas de potentiel pDC Oui: Les souris dénuées du régulateur IRF8 sont dépourvues de pDCs et de cDCs Quels signaux/facteurs sont requis pour la différenciation des pDC ?

Une vue génomique des cellules dendritiques Assemblage de profils d’expression génique pour la plupart des types cellulaires immunitaires (macrophages, neutrophiles, lymphocytes B, T, NK, pDCs, cDCs) Pour l’homme et la souris Clustering pour visualiser les distances entre lignage Identification de programmes d’expression géniques conservés Robbins et al, 2008

1. SOURIS Similitude des profils transcriptomiques des DC Principal component analysis (PCA) (Projection on first 2 dimensions) Hierarchical clustering

2. HOMME Similitude des profils transcriptomiques des DC Publicly available datasets on Affymetrix U133 v2 2. HOMME

Signature des DC de souris Pan-DC genes Conventional DC genes pDC specific genes (500 genes) (Fuzzy C-means clustering)

Signatures des DC humaines Conventional DC genes Pan DC genes pDC genes

B cells T cells pDCs cDCs Gènes les plus fortement associés à des types de cellules spécifiques Rouge: connu pour être spécifique de ces lignages B cells T cells pDCs cDCs Ebf1 Camk4 Epha2 Arhgap22 Cd19 4430004N04Rik Pacsin1 Btbd4 Klhl14 Trat1 Zfp521 Slamf8 Bank1 CxCr6 Sh3bgr 9130211l03Rik Pax5 Tnfrsf25 Tex2 Nav1 Blr1 Ccdc64 Runx2 Ct2a Ralgps2 Plcg1 Atp13a2 Avpi1 CD79b Lat Maged1 Spint1

Conclusion des études transcriptomiques Proximité des programmes géniques des pDC et cDC Programme conservés entre l’homme et la souris Les gènes spécifiques des DCs sont largement inconnus

Nature Immunology, October 7th, 2007

Homologies entre les sous-types de cellules dendritiques chez l’homme et la souris

Autres applications du compendium Classification de nouvelles populations cellulaires

suggéré comme étant un sous-type de pDC Les cellules IkDC sont-elles des cellules dendritiques ? Interferon-producing killer dendritic cells (IkDC): Capables de produire de l’IFNa/b expriment certains marqueurs des DCs propriétés cytotoxiques suggéré comme étant un sous-type de pDC Les IkDC sont un sous-type de cellules NK, et ne sont pas apparentées aux DC!

Les DCs dérivées des monocytes in vitro sont distinctes des DCs résidentes human mouse

Exemple 4: Absence de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) chez les mutants IkL/L

Les pDC sont-elles bloquées dans leur différenciation dans la moelle osseuse ? Présence d’une population exprimant un marqueur des pDC, 120G8, mais pas B220

La population 120G8+ mutante appartient-elle au lignage des pDC ? Analyse du transcriptome (Affymetrix: 45000 gènes) Comparaison à divers types cellulaires hématopoïétiques

Les pDC IkL/L possèdent la signature pDC Dérégulation (surexpression) d’un grand nombre de gènes Sous-signature commune avec les DC conventionnelles

Surexpression de la plupart des gènes dérégulés

Applications des microarrays 3. Data mining Recherche d’informations « cachées » dans les données de transcriptome Confrontation des données: - à d’autres sets de données transcriptomiques - aux données de séquence et d’organisation des génomes - aux données de fonctions des gènes

Exemple 4: signatures transcriptomiques dans le lupus (maladie auto-immune) J. Exp. Med. 197, 711-723 (2003)

Signatures « interféron » et « granulopoièse » chez les patients atteints de lupus

Analyse transcriptomique hypothèses Rôle de l’interféron dans la pathologie du lupus Différenciation anormale des granulocytes dans le sang des patients lupiques

Exemple 5 (Nature 2006) -Etude des réponses immunitaires de l’hôte après infection par des souches d’influenza de pathogénicité différente chez la souris Analyse du transcriptome des cellules du poumon après 1, 3 et 5 jours d’infection.

Souche de la pandémie 1918: réaction beaucoup plus importante de l’hôte, conduisant à la destruction de tissu

Conclusion Transcriptome: outil puissant pour: 1. Obtenir une vision d’ensemble d’un système biologique (classification des échantillons) 2. Effectuer une analyse sans à priori (identification de voies moléculaires et gènes potentiellement importants)  hypothèses